Influenza A Viruses Replicate Productively in Mouse Mastocytoma Cells (P815) and Trigger Pro-inflammatory Cytokine and Chemokine Production through TLR3 Signaling Pathway

doi:10.3389/fmicb.2016.02130

.2017年1月12:7:2130。

doi:10.3389/fmicb.2016.02130。电子收集2016。

甲型流感病毒在小鼠肥大细胞瘤细胞（P815）中高效复制并通过TLR3信号通路触发促炎细胞因子和趋化因子的产生

附属公司

¹中国农业大学兽医学院农业部动物流行病学与动物疫病重点实验室。
²中国农业大学兽医学院农业部动物流行病学与动物疫病重点实验室；中国畜牧业股份有限公司中牧研究院农业部兽医生物生产与化学药物重点实验室北京。
³北京农业大学中国兽医北京重点实验室。
⁴中南大学长沙湘雅医院分子医学中心。

PMID： 28127293
预防性维修识别码： PMC5226950型
内政部： 10.3389/fmicb.2016.02130

甲型流感病毒在小鼠肥大细胞瘤细胞（P815）中高效复制并通过TLR3信号通路触发促炎细胞因子和趋化因子的产生

狄蒙等。前部微生物. 2017.

.2017年1月12:7:2130。

doi:10.3389/fmicb.2016.02130。电子收集2016。

作者

狄蒙¹, 霍彩云¹, 王明（Ming Wang）², 金晓², 刘波（Bo Liu）¹, 唐廷伟¹, 洪东³, 张国忠¹, 胡彦欣¹, 孙伦泉⁴

附属公司

¹中国农业大学兽医学院农业部动物流行病学与动物疫病重点实验室。
²中国农业大学兽医学院农业部动物流行病学与动物疫病重点实验室；中国畜牧业股份有限公司中牧研究院农业部兽医生物生产与化学药物重点实验室北京。
³北京农业大学中国兽医北京重点实验室。
⁴中南大学长沙湘雅医院分子医学中心。

PMID： 28127293
预防性维修识别码： PMC5226950型
内政部： 10.3389/fmicb.2016.02130

摘要

甲型流感病毒（IAV）可导致人类和动物的急性呼吸道感染。肥大细胞作为宿主防御系统初始线的一员，在IAV感染过程中的作用尚不清楚。在这里，我们首次确定小鼠肥大细胞瘤细胞系（P815）表达了类禽（α-2，3-连锁）和类人（α-2、6-连锁）唾液酸（SA）受体。P815细胞确实支持H1N1（A/WSN/33）、H5N1（A/chicken/Henan/1/04）和H7N2（A/chiken/Heben/2/02）的生产性复制在体外而体内小鼠鼻粘膜和肺组织的特异性染色证实H5N1感染肥大细胞。所有这三种病毒都会触发受感染的P815细胞产生促炎细胞因子和趋化因子，包括IL-6、IFN-γ、TNF-α、CCL-2、CCL-5和IP-10，但不会产生抗病毒I型干扰素。进一步证实TLR3通路参与了P815细胞对IAV感染的应答。我们的发现突出了IAV对P815细胞的显著嗜性和传染性，表明肥大细胞可能在IAV感染的发展中起着不可忽视的作用。

关键词：TLR3途径；趋化因子；甲型流感病毒；肥大细胞；促炎细胞因子。

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数字

图1
**P815细胞表达α-2，3-和α-2,6-连接的唾液酸（SA）受体。（A）**将小鼠肥大细胞瘤细胞系P815置于聚赖氨酸涂层玻片上，并用FITC-共轭SNA或MAA-I（绿色）和DAPI（蓝色）对细胞核进行染色。图像插页显示细胞预先用神经氨酸酶处理以消除唾液酸残留染色。**（B）**将胰蛋白酶化P815细胞与FITC-共轭SNA或MAA-I孵育（从左到右的浓度分别为5、10和20μg/ml），并使用流式细胞术进行分析，以确定表达α-2,3-SA（MAA，粉红色）或α-2,6-SA（SNA，绿色）的细胞与未染色细胞（黑色）相比的相对百分比。“NA-MAA”和“NA-SNA”表明P815细胞预先用神经氨酸酶处理，以消除唾液酸残留染色。显示的结果代表了三个独立的实验。

图2
流感病毒可以感染P815细胞*在体外*用三种亚型流感病毒以0.1的MOI模拟处理或感染P815细胞。**（A）**P815细胞中病毒核蛋白（NP）抗原和SA受体的免疫荧光检测。在感染后的指定时间，对细胞进行固定，并对其进行α-2,6-或α-2,3-唾液酸（绿色）和流感NP（红色）染色。显示的结果代表了三个单独的实验。**（B）**从细胞表面释放的流感病毒的透射电子显微镜。右边的框中有较高的放大倍数。箭头表示病毒颗粒。

图3
**H5N1流感病毒可感染小鼠肥大细胞体内**。来自对照组或H5N1病毒感染小鼠的代表性鼻粘膜和肺切片。切片通过免疫荧光染色进行分析（蓝色=细胞核，红色=类胰蛋白酶，绿色=流感NP）。显示的结果代表了三个独立重复。

图4
**流感病毒感染导致释放促炎细胞因子和趋化因子。（A）**P815细胞以0.1的MOI感染H1N1、H5N1和H7N2，或模拟处理24小时。然后使用细胞因子阵列面板分析无细胞上清液中的细胞因子和趋化因子含量。带数字的方框表示表达上调，最显著的增长以粗体标注。显示的结果代表了两个单独的实验。**（B）**P815细胞以0.1的MOI感染H1N1、H5N1和H7N2，暴露于LE-PolyI:C或模拟治疗。在指定的时间点采集细胞上清液，用ELISA分析IL-6、IFN-γ、CCL-2、CCL-5、IP-10 TNF-α、IFN-α和IFN-β的表达。图中所示为三个独立重复的平均值±SD。星号表示与模拟治疗相比在统计上显著增加(^∗*P（P）*< 0.05,^∗∗*P（P）*< 0.01). ND，未检测到。

图5
**甲型流感病毒上调TLR3和TRIF mRNA和蛋白的表达**P815细胞按照**图4B**.（A）在设计时间分离总RNA，并用实时定量PCR进行检测。图中显示了TLR3和TRIF的表达。数据显示为模拟治疗的相对折叠变化，并从三个独立实验中汇总。**（B）**在感染或治疗后2、6、12和24小时收集P815细胞，然后通过免疫印迹分析TLR3、TRIF、病毒NS1蛋白和β-肌动蛋白的表达。数据代表了三个单独的实验。**（C）**TLR3与TRIF的内源性相互作用。感染后6小时的全细胞提取物（TLR3-TRIF）用指定的抗体或同种型IgG对照进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹分析进行分析。

图6
**Toll样受体/dsRNA复合物抑制剂可减少IAV感染的P815细胞释放促炎细胞因子**用TLR3/dsRNA复合物抑制剂处理的P815细胞以0.1的MOI感染H1N1、H5N1和H7N2，暴露于LE-PolyI:C或模拟处理。在指定的时间点，收集细胞上清，并通过ELISA分析TNF-α、IL-6、IFN-γ和CCL-2的表达。图中所示为三个独立重复的平均值±SD。星号表示与模拟治疗相比在统计上显著增加(^∗*P（P）*< 0.05,^∗∗*P（P）*< 0.01).

图7
**Toll样受体/dsRNA复合物抑制剂可降低P815细胞中IAV的病毒载量**用TLR3/dsRNA复合物抑制剂处理的P815细胞以0.1的MOI感染H1N1、H5N1和H7N2，暴露于LE-PolyI:C或模拟处理。细胞在Trizol中均质，并通过实时PCR测定病毒NS基因的相对定量**（A）**在感染后的指定时间收集培养上清液，并通过菌斑试验测定上清液中的病毒滴度**（B）**。所示结果来自三个独立重复。星号表示与模拟治疗相比在统计上显著增加(^∗*P（P）*< 0.05,^∗∗*P（P）*< 0.01).

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