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.2017年2月28日；8(9):15114-15125.
doi:10.18632/目标14750。

SETD6在尿路上皮细胞存活中调节NF-κB信号传导：与膀胱癌的关系

尼拉姆·穆克吉 1, 爱德华多·卡德纳斯 1, 罗伯·贝多拉 1, 丽塔·戈什 1 2 三 4
附属公司

SETD6在尿路上皮细胞存活中调节NF-κB信号传导：与膀胱癌的关系

尼拉姆·穆克吉等。 Oncotarget公司. .

摘要

非肌肉浸润性膀胱癌的复发率高达45-70%，其中约15%的患者在5年内发展为肌肉浸润性疾病。治疗中经常使用分枝杆菌、卡介苗（BCG），这种细菌会诱发局部炎症，导致反应患者的肿瘤缓解。卡介苗治疗的NF-κB del/del基因型患者复发风险增加，提示NF-κ的B在膀胱癌中起重要作用。由于蛋白甲基转移酶在调节染色质结构和基因表达方面起着关键作用，我们筛选了一系列表观遗传修饰基因，以确定正常尿路上皮细胞和膀胱癌细胞之间的差异表达。我们发现并验证了含SET域的蛋白甲基转移酶SETD6的高表达。赖氨酸310处的SETD6单甲基化NF-κB-65。我们的结果表明，原代尿路上皮细胞和正常膀胱组织几乎检测不到SETD6的信息和蛋白水平，SETD6在转化的尿路内皮细胞中增加，在膀胱癌细胞和组织中进一步增加。SETD6在转化的尿路上皮细胞中的过度表达增加了细胞存活率和集落形成，而在癌细胞中的敲除降低了这两个参数。荧光素酶报告子分析表明，SETD6诱导了典型的NF-κB信号通路。此外，催化性SETD6和IκBα突变体的使用表明，SETD6通过影响p65信息、蛋白质水平及其功能（由NF-κB靶基因的表达增加决定）来积极调节存活率。我们的研究结果表明，SETD6在NF-κB调节中起着重要作用，并可能在卡介苗治疗后NF-κ的B介导的局部炎症反应中起重要作用。

关键词：核因子-κB；SETD6；膀胱癌；甲基转移酶；发出信号。

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利益冲突声明

利益冲突

未申报。

数字

图1
图1。SETD6在膀胱癌中的上调
(A类)使用qPCR验证SETD6在不同膀胱细胞中的相对表达。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。将样品分为三份进行测量，并重复实验3次。(B类)对膀胱癌组织进行cDNA阵列分析(n个=24）代表不同阶段，用qPCR分析SETD6的表达。(C类)用抗SETD6抗体通过免疫印迹法检测SETD6蛋白的基本水平。(天)不同膀胱癌细胞系细胞的免疫细胞化学显示胞质和细胞核SETD6。(E类)用抗SETD6抗体western blot检测膀胱癌组织中SETD6蛋白(n个=9）与非癌膀胱组织相比。
图2
图2。SETD6积极调节生存率
野生型SETD6在SVHUC1细胞系中过度表达。EV:pCAG；pSD6:pCAG-标签设置D6。(A类)台盼蓝和(B类)结晶紫染色法检测细胞存活率。重复计数样品，重复实验2次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。(C类)采用MTT法测定生长。样品测量为三份，实验重复三次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。突变（mut）SETD6 Y285A在SVHUC1细胞系中过度表达。EV:pCAG；pmSD6:pCAG-Flag突变体SETD6（Y285A）。(天)台盼蓝和(E类)结晶紫染色法检测细胞存活率。重复计数样品，重复实验2次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。(F类)采用MTT法测定生长。样品测量为三份，实验重复2次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。SETD6在膀胱癌细胞系中被敲除(G公司)在UMUC3和(H（H）)RT4和台盼蓝试验用于测定细胞存活率。NTC：非靶向对照siRNA；si-SD6:SETD6 siRNA。重复计数样品，重复实验两次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。
图3
图3。SETD6诱导典型NF-κB信号
SETD6过度表达对(A类)p65 mRNA和(B类)通过RT-PCR测定IκBαmRNA（SETD6过度表达后18小时）。样品测量为三份，实验重复三次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。EV：（空向量）pCAG；pSD6:pCAG-标签设置D6。(C类)免疫印迹显示野生型（wt）SETD6过度表达对p65的影响，使用全细胞和细胞核提取物。EV（空向量）：pCAG；pSD6:pCAG-标签设置D6。使用全细胞提取物测试NF-κB家族的其他成员。(天)突变（mut）SETD6过度表达对p65和NF-κB家族其他成员的影响，如面板C。EV（空载体）：pCAG；pmSD6:pCAG-Flag突变体SETD6（Y285A）。SETD6基因敲除对p65的影响(E类)UMUC3和(F类)RT4。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。实验重复了两次。NTC：非靶向控制siRNA；si-SD6:SETD6 siRNA。
图4
图4。SETD6介导的p65水平增加细胞存活率
(A类)通过台盼蓝试验测定野生型（wt）SETD6和突变型（mut）IκB过度表达对SVHUC1细胞存活的影响。对样品进行了重复测量，并重复了两次实验。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。车道1 EV（空向量）：pCAG+pcDNA；车道2 EV（空矢量）：pCAG；pSD6:pCAG-Flag SETD6；mIκBα：pcDNA-突变型IκBα（S32/36A）。wt SETD6过表达对(B类)western印迹法测定p65的核水平及其对其影响(C类)荧光素酶活性测定NF-κB的转录报告活性。将样品分成三份进行测量，并重复实验两次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。(天)通过荧光素酶活性测量mut SETD6过度表达对NF-κB转录活性的影响。样品测量为三份，实验重复两次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。(E类)通过RT-PCR测定SETD6过表达对NF-κB靶基因表达的影响（SETD6过度表达后24小时）。样品测量为三份，实验重复两次。p≤0.05被认为具有统计学意义（*）。EV（空向量）：pCAG；pSD6:pCAG-标签设置D6。(F类)SETD6在膀胱癌中的作用模型：SETD6通过增加p65水平及其核移位诱导NF-κB信号传导，从而提高转化膀胱细胞的存活率。
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