Heparan Sulfates Support Pyramidal Cell Excitability, Synaptic Plasticity, and Context Discrimination

doi:10.1093/cercor/bhx003

.2017年2月1日；27(2):903-918.

doi:10.1093/cercor/bhx003。

硫酸肝素支持金字塔细胞兴奋性、突触可塑性和上下文辨别

附属机构

¹波恩大学医学院细胞神经科学研究所，德国波恩53105。
²德国神经退行性疾病中心（DZNE），39120 Magdeburg，Germany。
^三意大利热那亚意大利技术研究所神经科学和脑技术部，16163。
⁴俄罗斯下诺夫哥罗德洛巴切夫斯基国立大学神经技术系，603950。
⁵俄罗斯下诺夫哥罗德国家医学院中央研究实验室，603005。
⁶荷兰奈梅亨拉德布德大学医学中心拉德布德分子生命科学研究所生物化学系。
⁷德国柏林莱布尼茨-摩尔库拉雷药物研究所（FMP）分子药理学和细胞生物学系，邮编：13125。
⁸Medizinische Fakultät，Otto-von-Guericke-Universityät Magdeburg，39120德国马格德堡。
⁹德国神经退行性疾病中心（DZNE），53175波恩，德国。
¹⁰英国伦敦WC1N 3BG伦敦大学学院神经病学研究所。

PMID： 28119345
预防性维修识别码：项目编号：5390399
内政部： 10.1093/cercor/bhx003

硫酸乙酰肝素支持锥体细胞的兴奋性、突触可塑性和上下文辨别

丹尼尔·明格等。大脑皮层. 2017.

.2017年2月1日；27(2):903-918.

doi:10.1093/cercor/bhx003。

附属机构

¹波恩大学医学院细胞神经科学研究所，德国波恩53105。
²德国神经退行性疾病中心（DZNE），39120 Magdeburg，Germany。
^三意大利技术研究所神经科学和脑技术系，意大利热那亚16163号。
⁴俄罗斯下诺夫哥罗德洛巴切夫斯基国立大学神经技术系，603950。
⁵俄罗斯下诺夫哥罗德国家医学院中央研究实验室，603005。
⁶荷兰奈梅亨拉德布德大学医学中心拉德布德分子生命科学研究所生物化学系。
⁷德国柏林莱布尼茨-摩尔库拉雷药物研究所（FMP）分子药理学和细胞生物学系，邮编：13125。
⁸Medizinische Fakultät，Otto-von-Guericke-Universityät Magdeburg，39120德国马格德堡。
⁹德国神经退行性疾病中心（DZNE），53175波恩，德国。
¹⁰英国伦敦WC1N 3BG伦敦大学学院神经病学研究所。

PMID： 28119345
预防性维修识别码：项目编号：5390399
内政部： 10.1093/cercor/bhx003

摘要

硫酸乙酰肝素（HS）蛋白聚糖是细胞外基质的主要成分，对大脑发育至关重要。然而，它们在成熟大脑中的功能仍有待确定。在这里，使用HS侧链的急性酶消化来揭示HS如何在体内外支持海马功能。我们发现，在用肝素酶1去除高硫酸化HS后，CA3-CA1-Schaffer侧支突触传递的长期增强（LTP）受损。这种减少与LTP诱导期间Ca2+内流减少有关，这是CA1锥体神经元兴奋性降低的结果。在亚细胞水平上，肝素酶处理导致远端轴突起始段的重组，如锚蛋白G表达减少所示。在体内，HS的消化损害了恐惧条件反射范式中的上下文辨别能力，并在恐惧条件反射后破坏了低θ带中的振荡网络活动。因此，HS维持神经元的兴奋性，从而支持突触可塑性和学习。

关键词：细胞外基质；硫酸乙酰肝素；学习；神经元兴奋性；突触可塑性。

©作者2017。牛津大学出版社出版。

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数字

**图1。**
去除HS会损害急性海马脑片中CA3–CA1 Schaffer侧支突触的突触传递LTP。(一,b条)原理图记录配置。fEPSP记录在CA1区放射层，并通过电刺激CA3–CA1 Schaffer侧支诱发。从对照组和肝素酶处理的切片中记录的fEPSP样本（左面板分别为蓝色和红色）。fEPSP斜率标准化为轴突纤维束，在对照组和肝素治疗组之间几乎无法区分(n个=9两组，中间面板）。条形图的刺激强度为100µA（请参见补充图2一–*c（c）*对于测试的完整刺激强度范围，归一化和统计前的纤维截击和斜率）。在存在0.1 mM Mg的情况下，记录NMDAR介导的fEPSP²⁺和AMPAR抑制剂NBQX，在对照组和肝素治疗组切片之间没有显著差异（右面板，n个=6两组，请参见补充图2d日刺激强度和统计数据的完整范围）。(*c（c）*)fEPSP配对脉冲比率在对照和肝素酶处理的切片之间没有差异(n个=9两者）。刺激间隔为50 ms（请参见补充图2d日,*e（电子）*对于样本记录道，测试和统计的完整间隔范围）。(d日)通过TBS诱导LTP。对照组和肝素治疗组切片（左面板分别为蓝色和红色）在诱导LTP之前（实线）和之后（虚线）显示样本痕迹。右侧面板显示了LTP实验中fEPSP斜率的时间过程(n个=8组，5个TBS循环）。(*e（电子）*)单个TBS诱导的LTP不受HS（1×TBS，n个=8两组，*P（P）*=0.267，未配对t吨-测试）。相反，强烈的LTP诱导刺激（5个TBS周期，n个=8两组，*P（P）*=0.0024，未配对t吨-试验）发现肝素酶处理的切片中存在LTP缺陷。GABA受体拮抗剂PTX（100µM，n个=8和7，对照组和肝素治疗组切片，*P（P）*=0.023，未配对t吨-测试）。

**图2。**
钙²⁺肝素处理的海马脑片在TBS期间CA1锥体细胞的棘和树突进入减少。(一)将CA1锥体细胞保持在全细胞膜片钳结构中，并通过贴片移液管填充Ca²⁺-敏感荧光染料Fluo-4（200µM）和形态标记Alexa Fluor 594（20µM。使用2PE荧光显微镜（激发波长800 nm）观察树突状体和突触棘。树突和脊椎的线扫描位置是伪随机选择的（插图中，用虚线表示线扫描位置，0.4–0.8 kHz）。(b条)监测荧光变化（线扫描、，一)在TBS（顶面板，刺激模式）期间，以电流钳模式（中面板）记录神经元。下图显示了假手术和肝素治疗切片的Fluo-4荧光的代表性线扫描（平均5 TBS）。(*c（c）*)Fluo-4荧光痕迹的全球平均值显示Ca减少²⁺肝素治疗切片的入口(n个=10和11，用于对照和肝素酶治疗）。(d日)钙²⁺通过计算∆量化条目F类/F类₀（有关详细信息，请参见材料和方法）。∆的较低值F类/F类₀在肝素酶处理的细胞中，钙减少²⁺去除HS后在TBS期间进入（双向重复测量ANOVA，*P（P）*=0.021，未配对t吨-测试单个脉冲）。在AP5在场的情况下进行了图示实验（更多详细信息见正文）。

**图3。**
钙²⁺肝素酶治疗不影响b-AP诱导的进入或直接去极化。(一)将金字塔细胞置于−70 mV的全细胞电压钳中，并通过贴片吸管注入钙²⁺-敏感荧光染料Fluo-4（200µM）和形态标记Alexa Fluor 594（20µM。使用2PE荧光显微镜在800 nm处观察树突状体和突触棘。树突和脊椎的线扫描位置是伪随机选择的（插图中，线扫描位置由虚线表示，0.4–0.8 kHz）。b-AP通过短暂（2–3 ms）电压跃至+10 mV（每个电压跃至2-3 ms，20 Hz时5个，底部面板中的动作电流限幅采样迹线）诱发。Fluo-4荧光线剖面图表明Ca浓度较高²⁺当Alexa Fluor 594荧光保持稳定时，对b-AP的反应。(b条,*c（c）*)在对照组和肝素酶处理的切片中b-AP序列期间Fluo-4荧光的时间进程。未检测到显著差异(n个假手术和肝素酶治疗分别为16和25，双向重复测量方差分析，*P（P）*= 0.96). (d日)钙²⁺FLIM对钙填充细胞中AP依赖的直接去极化反应的进入进行了研究²⁺-敏感荧光染料俄勒冈绿BAPTA-1（OGB1，200µM，请参阅补充图3和文本了解更多详细信息）。钙²⁺在TTX（1µM）存在下，通过从−70到+20 mV的短暂电压阶跃25 ms（3×1 Hz）诱发反应。OGB1寿命转化为Ca²⁺绘制了浓度及其时间进程。对照组和肝素酶处理的脊椎和树突之间未检测到显著差异(n个=13，用于控制脊椎，所有其他n个=12，振幅双向重复测量方差分析，*P（P）*对于树突为0.39，对于棘为0.55）。

**图4。**
肝素酶治疗后，在TBS和类TBS电流注射期间，CA1锥体细胞产生较少的动作电位。(一,b条)对照组（蓝色，顶部）和肝素酶（红色，中间面板）处理切片（刺激模式，底部面板）突触TBS期间CA1锥体细胞的典型电流钳记录。请注意，肝素酶治疗后单个爆发期间产生的动作电位数量减少。对每次爆发的峰值数量进行分析，在5个TBS周期内平均，发现肝素治疗神经元的峰值数量更低（双向重复测量方差分析，*P（P）*= 0.003,n个对于对照切片为5，对于肝素酶处理的切片为7）。(*c（c）*,d日)类TBS模式的电流注入（40 ms，5 Hz时8次，5个周期，如一,b条)从肝素酶处理的切片中诱发CA1锥体细胞的较少动作电位（双向重复测量方差分析，*P（P）*= 0.040,n个=13和12，对照组和肝素酶处理的切片，未配对t吨-测试单个脉冲）。这表明神经元兴奋性降低可能是钙缺乏的基础²⁺流入和LTP。(*e（电子）*)肝素酶治疗后，类TBS电流注射诱发的棘波阈值逐渐增加。虽然在每次爆发的第一个峰值上没有观察到任何影响（双向重复测量方差分析，*P（P）*=0.239）在重复刺激期间，第二个峰值的阈值增加（双向重复测量方差分析，*P（P）*=0.031，未配对t吨-单个脉冲测试；第一个和第二个尖头，填充和空圆圈；如上所述的颜色编码，n个=13，用于控制和n个=13和12（第一个峰值），13和10（第二个峰值）。(*（f）*)当通过电流钳配置中强度增加的恒定电流注入（与*e（电子）*，样本记录道和电流注入左侧面板，统计右侧面板，n个=10用于对照，8用于肝素酶治疗，双向重复测量方差分析，*P（P）*=0.043和0.030，未配对t吨-测试）。

**图5。**
肝素酶治疗后，远端AIS中AnkG表达降低。(一)在Thy1启动子下表达荧光蛋白YFP（绿色）的小鼠（Feng等人，2000年）被用于鉴定CA1锥体细胞及其推测的AIS。AIS是通过与小鼠抗AnkG抗血清（品红色）混贴而可视化的。(b条)肝素酶处理切片AIS的AnkG标记样本（顶部面板放大自一，虚线框）和控制片（中间面板）。游离培养物中的AnkG标记（见补充图8和结果）预测肝素酶治疗后ASI AnkG标记的远端减少。因此，轴突AnkG分布是通过从锥体细胞体中心开始沿AIS绘制线剖面图（宽度=0.57µm）来确定的。示例的背景校正AnkG曲线如底部面板所示（蓝色对照，红色肝素酶）。(*c（c）*)为了避免因AIS起始值的大变异性而导致AnkG轮廓扭曲（参见结果和补充图9），我们仅选择AIS起始于平均值±3×SEM范围内的轴突AnkG剖面进行进一步分析。显示了平均荧光强度分布(n个=对照组为17，肝素酶处理切片为21）。注意，在这些图中，距离是相对于躯体中心给出的。(d日)在肝素治疗的切片中，远端AIS（距躯体中心30–40µm）的平均背景校正AnkG信号降低(*P（P）*=0.0019，未配对t吨-测试）。(*e（电子）*)当轴突AnkG轮廓被归一化为轴突丘附近获得的值以解释激发和荧光标记检测的变化时，也得到了类似的结果(*P（P）*=0.00049，未配对t吨-测试）。

**图6。**
海马内注射肝素酶1会损害CFC的上下文辨别能力。(一)CFC的实验设计，在CFC前24小时注射活性肝素酶（肝素酶）或热灭活肝素酶。(b条)注射肝素酶的小鼠组在d0 CFC前的中性环境（CC-）和d1和d3 CFC后的条件环境（CC+）中表现出正常的冷冻水平。然而，他们无法区分条件性上下文（CC+，实心条）和非条件性中性上下文（CC-，空条）。(*c（c）*)对照组/肝素酶注射后，在2种不同环境下（左侧面板）冷冻的辨别率（%）证实，在背海马注射肝素酶去除HSs后，小鼠无法辨别2种不同但相似的环境。

**图7。**
海马内注射肝素酶可以改变CFC期间的θ振荡。(一)将海马电极和插管以给定坐标和HIME系统特定布置外科植入小鼠大脑的示意图（Senkov等人，2015年）。(b条)脑切片的尼斯氏染色，其电极轨迹位于右背海马，描绘了DG处最深电极的尖端和CA1锥体细胞层处最浅电极的尖端。(*c（c）*)两个记录区域（CA1和DG）和两个治疗组的LFP代表性时段均显示出高θ振荡（Hθ：7–10 Hz），而小鼠在冷冻时探索条件情境（CC+）和低θ（Lθ：4–7 Hz）。(d日)肝素酶或对照注射后第1天CC+中5分钟低频振荡（2–20 Hz）的典型频谱图示例。低θ振荡在冰冻事件中表现出高功率，而高θ振荡仅在探测/运动时期出现。与对照组相比，注射肝素酶的小鼠在提取CFC记忆痕迹期间表现出低θ振荡的功率降低。(*e（电子）*)对所有记录日的θ峰值频率的分析表明，当小鼠探索（exp）上下文（CC+/CC−）和冻结（fr）时，两个治疗组的θ频率从Hθ（7–10 Hz）移到Lθ（4–7 Hz）。(*（f）*)在探索行为期间，冷冻期间相对于Lθ功率归一化的Lθ功耗的分析表明，CC+小鼠冷冻期间Lθ的功耗显著增加（～100%），而对照小鼠的CC−小鼠冷冻期间的功耗增加较低。在注射肝素的动物中，检测到了一种性质相反的效果，即在冷冻期间CC-的Lθ功率增加超过CC+。(克,小时)CFC后的平均低（4–7 Hz）θ功率被归一化为换挡前的调节水平（基线，B）。在对照实验中，在CFC后可以检测到Lθ功率显著增加，但在注射肝素的动物中没有检测到（小时; * 两个治疗组在CC+上下文中θ幂的显著差异；+，++，+++两个治疗组在CC−环境中的θ幂存在显著差异）。

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1. Anagonostaras SG、Maren S、Sage JR、Goodrich S、Fanselow MS，1999年。大鼠东莨菪碱和巴甫洛夫恐惧条件反射：剂量效应分析。神经精神药理学。21:731–744。-公共医学
1. Anders S、Minge D、Griemsmann S、Herde MK、Steinhäuser C、Henneberger C，2014年。大鼠海马星形胶质细胞缝隙连接耦合的空间特性。Phil Trans R Soc B.369:20130600。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Colgin律师事务所。2016年，《海马神经网络的节律》，《Nat Rev Neurosci》。17:239–249.-项目管理咨询公司-公共医学
1. 科伦贝利C、帕尔米萨诺M、埃舍德·伊森巴赫Y、赞布罗尼D、帕沃尼E、费里C、萨科奇S、妮科尔S、索尼宁R、麦基KK等。2015年。Perlecan被肌营养不良聚糖募集到Ranvier的淋巴结，并与聚集分子胶质细胞介素结合。细胞生物学杂志。208:313–329.-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Agronskaia AV、Tertoolen L、Gerritsen HC。活细胞中钙的快速荧光寿命成像。J生物识别选项。9:1230–1237.-公共医学

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[6] Anders S、Minge D、Griemsmann S、Herde MK、Steinhäuser C、Henneberger C，2014年。大鼠海马星形胶质细胞缝隙连接耦合的空间特性。Phil Trans R Soc B.369:20130600。-项目管理咨询公司-公共医学

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[10] 科伦贝利C、帕尔米萨诺M、埃舍德·伊森巴赫Y、赞布罗尼D、帕沃尼E、费里C、萨科奇S、妮科尔S、索尼宁R、麦基KK等。2015年。Perlecan被肌营养不良聚糖募集到Ranvier的淋巴结，并与聚集分子胶质细胞介素结合。细胞生物学杂志。208:313–329.-项目管理咨询公司-公共医学

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