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比较研究
.2017年3月1日；156(1):275-288.
doi:10.1093/toxsci/kfw254。

编辑亮点：大鼠背根神经节培养物的多参数图像分析用于评价周围神经病变诱导化疗

梁国 1, 约翰·哈姆雷第三 1, 桑迪·埃尔德里奇 2, 霍尔格·P·贝尔辛 1, 面部M角质 1, 朱迪·穆西奥 1, 默特尔·戴维斯 2
附属公司
比较研究

编辑亮点：大鼠背根神经节培养物的多参数图像分析以评估外周神经病诱导化疗

梁国等。 毒理学科学. .

摘要

化疗诱导的周围神经病变（CIPN）是癌症患者经历的一种主要的、剂量有限的不良反应。适当的体外检测有助于基于机制的CIPN风险缓解和有效治疗的进展。为此，我们开发了一种以多参数形态学为中心的大鼠背根神经节（DRG）检测方法。用自动显微镜系统分析神经元和非神经元亚细胞结构的形态学变化。NeuN（一种神经元特异性核蛋白）和Tuj-1（β-III微管蛋白）的染色分别用于识别神经元细胞核和神经元胞体/突起。波形蛋白染色（施万细胞中间丝的一种成分）用于标记非神经元支持细胞。DAPI染色但缺乏NeuN的细胞核代表非神经元细胞。在连续暴露于CIPN诱导剂24小时和药物去除72小时后分析图像，以提供初始药物效应恢复的动态测量。硼替佐米、顺铂、埃里布林、紫杉醇或长春新碱治疗可诱导轴突/突起区域的剂量依赖性丢失，模拟轴突的“死后”变性，这是体内临床CIPN的组织病理学特征。对于所有五种CIPN诱导药物，神经突丢失的IC50在最大临床暴露（Cmax）的3倍以内，但对于两种非CIPN诱发药物，IC50大于或≥Cmax的28倍。还观察到了复合特异性效应，如顺铂或硼替佐米破坏神经突，紫杉醇使神经元胞体增大。总之，这些结果支持使用定量、形态学评估和DRG细胞培养模型来告知CIPN的风险并检查其机制。

关键词：自动图像分析；早期安全评估。；化疗所致周围神经病变；高含量分析；大鼠背根神经节细胞（DRGs）。

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数字

图1
图1
DRG实验程序图解。细胞被镀并用有丝分裂抑制剂培养至镀后第4天。加入药物，培养无核分裂抑制剂的细胞，进行24小时药物暴露。在第5天药物暴露结束时（24小时时间点）或在第8天药物去除后额外72小时观察期（72小时时间点。细胞电镀后第1天、第4天和第5天更换培养基。
图2
图2
Tuj-1和vimentin分别作为培养的神经元和非神经元DRG细胞的特异性标记物。A、 Tuj-1、vimentin和GAPDH的Wes™Simple Western印迹的全长图像）。在第8天（72 h时间点）；80℃时每个毛细管中装载的裂解物 pg蛋白，用抗uj-1（MO15013 1:50，加抗GAPDH 1:100）或抗波形蛋白（AB8069 1:1000，加抗-GAPDH 1:100）检测；在第55、58和42天检测到Tuj-1、Vimentin和GAPDH 分别为kDa。B、 Tuj-1和波形蛋白表达标准化为GAPDH（平均值 ± 扫描电镜，n个 = 3–4). C、 四个通道的代表字段；从车辆控制井用20倍物镜拍摄的合并图像。神经元、神经突和非神经元细胞的突起分别为Tuj-1（红色）和Vimentin（绿色）染色阳性；闭合箭头指向神经元细胞体（红色Tuj-1）和细胞核（白色NeuN）；开放箭头指向突起和突起紧密接触的单线运动；恒星表示具有与雪旺细胞不同的独特形态的细胞。
图3
图3
使用IN Cell Workstation软件进行多参数分析的图像处理。A和B，分别与NeuN和Tuj-1通道或DAPI和vimentin通道合并的荧光图像；C和D，显示细胞核（蓝色圆圈）、细胞体（绿色圆圈）和神经突或非神经元细胞过程（黄色圆圈）的分割。每个图像中的箭头指向神经元细胞（A和C）或非神经元细胞的相同细胞核。比例尺 = 40微米。
图4
图4
长春新碱对培养的DRG细胞的影响。A、 B、E和F，药物暴露24小时（A和B）或药物去除72小时（E和F）后拍摄的合并图像；比例尺，40 微米。药物暴露24小时（C和D）或药物去除72小时（G和H）后，对神经元（C和G）或非神经元（D和H）细胞的细胞计数或加工面积的浓度依赖性影响，以溶媒对照的百分比表示。平均值 ± 扫描电镜；n个 = 3个重复实验*P（P） < 与相应的溶媒对照品相比，药物浓度为0.05；P（P）每个图左下角的值表示细胞计数与神经突起或突起面积之间变化的显著性水平，这是由双向方差分析确定的。
图5
图5
灯盏花素对培养的DRG细胞的影响。A、 B、E和F，药物暴露24小时（A和B）或药物去除72小时（E和F）后拍摄的合并图像；比例尺，40 微米。药物暴露24小时（C和D）或药物去除72小时（G和H）后，对神经元（C和G）或非神经元（D和H）细胞的细胞计数或加工面积的浓度依赖性影响，以溶媒对照的百分比表示。平均值 ± 扫描电镜；n个 = 3个重复实验*P（P） < 与相应的溶媒对照品相比，药物浓度为0.05；P（P）每个图左下角的值表示细胞计数与神经突起或突起面积之间变化的显著性水平，这是由双向方差分析确定的。
图6
图6
紫杉醇对培养的DRG细胞的影响。A、 B、E和F，药物暴露24小时（A和B）或药物去除72小时（E和F）后拍摄的合并图像；箭头指向从增大的神经元细胞体投射出来的肿胀的神经突。比例尺，40 微米。药物暴露24小时（C和D）或药物去除72小时（G和H）后，对神经元（C和G）或非神经元（D和H）细胞的细胞计数或加工面积的浓度依赖性影响，以溶媒对照的百分比表示。平均值 ± 扫描电镜；n个 = 6个重复实验*P（P） < 与相应的溶媒对照品相比，药物浓度为0.05；P（P）每个图左下角的值表示细胞计数与神经突起或突起面积之间变化的显著性水平，这是由双向方差分析确定的。拟合24时的神经元和非神经元细胞计数 h未收敛。
图7
图7
顺铂对培养的DRG细胞的影响。A、 B、E和F，药物暴露24小时（A和B）或药物去除72小时（E和F）后拍摄的合并图像；箭头指向支离破碎的神经突起，箭头指向非神经元细胞的支离破碎过程；比例尺，40 微米。药物暴露24小时（C和D）或药物去除72小时（G和H）后，对神经元（C和G）或非神经元（D和H）细胞的细胞计数或加工面积的浓度依赖性影响，以溶媒对照的百分比表示。平均值 ± 扫描电镜；n个 = 3个重复实验*P（P） < 与相应的溶媒对照品相比，药物浓度为0.05；P（P）每个图左下角的值表示细胞计数与神经突起或突起面积之间变化的显著性水平，这是由双向方差分析确定的。
图8
图8
硼替佐米对培养的DRG细胞的影响。A、 B、E和F，药物暴露24小时（A和B）或药物去除72小时（E和F）后拍摄的合并图像；比例尺，40 微米。药物暴露24小时（C和D）或药物去除72小时（G和H）后，对神经元（C和G）或非神经元（D和H）细胞的细胞计数或加工面积的浓度依赖性影响，以溶媒对照的百分比表示。平均值 ± 扫描电镜；n个 = 6个重复实验*P（P） < 与相应的溶媒对照品相比，药物浓度为0.05；P（P）每个图左下角的值表示细胞计数与神经突起或突起面积之间变化的显著性水平，这是由双向方差分析确定的。拟合24时的神经元计数 h没有收敛。
图9
图9
沙利度胺、吉非替尼和羟基脲对培养的DRG细胞的影响。药物暴露24小时（A和B）或药物去除72小时（C和D）后，对神经元（A和C）或非神经元（B和D）细胞的细胞计数、轴突或加工区的浓度依赖性效应，以溶媒对照的百分比表示。平均值 ± 扫描电镜；n个 = 反应停重复实验6次，吉非替尼和羟基脲重复实验3次。P（P）由双向方差分析确定的值表示细胞计数与突起或突起面积之间差异的显著性水平。
图10
图10
暴露24小时或药物去除72小时后，紫杉醇诱导的神经元细胞体肿胀（A）和顺铂诱导的轴突断裂（B）的量化。将数据归一化到各个车辆控制组，并表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 6个重复实验）*P（P） < 与对照组比较，0.05。
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参考文献

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