Foot-and-mouth disease virus infection suppresses autophagy and NF-кB antiviral responses via degradation of ATG5-ATG12 by 3Cpro

doi:10.1038/cddis.2016.489

.2017年1月19日；8（1）：e2561。

doi:10.1038/cddis.2016.489。

口蹄疫病毒感染通过3C降解ATG5-ATG12抑制自噬和NF-кB抗病毒反应^{赞成的意见}

徐旭凡¹, 韩世充^1 2, 丹燕¹, 袁高¹, 盐泉卫¹, 刘向涛¹, 英廖^三, 郭慧晨¹, 孙世奇¹

附属公司

¹中国农业科学院兰州兽医研究所兽医病原生物学国家重点实验室和国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州。
²中国农业大学兽医学院农业部动物疫病重点实验室，北京市海淀区。
^三中国农业科学院上海兽医研究所鸟类疾病科，中国上海。

PMID： 28102839
预防性维修识别码：下午5386389
内政部： 10.1038/cddis.2016.489

口蹄疫病毒感染通过3C降解ATG5-ATG12抑制自噬和NF-кB抗病毒反应^{赞成的意见}

徐旭凡等。细胞死亡病. 2017.

.2017年1月19日；8（1）：e2561。

doi:10.1038/cddis.2016.489。

作者

徐旭凡¹, 韩世充^1 2, 丹燕¹, 袁高¹, 盐泉卫¹, 刘向涛¹, 英廖^三, 郭慧晨¹, 孙世奇¹

附属公司

¹中国农业科学院兰州兽医研究所兽医病原生物学国家重点实验室和国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州。
²中国农业大学兽医学院农业部动物疫病重点实验室，北京市海淀区。
^三中国农业科学院上海兽医研究所鸟类疾病科，中国上海。

PMID： 28102839
预防性维修识别码：项目编号5386389
内政部： 10.1038/cddis.2016.489

摘要

自噬相关蛋白ATG5-ATG12是自噬过程中自噬体延长的重要复合物，据报道，自噬与口蹄疫病毒（FMDV）复制有关。以往的研究表明，ATG5-ATG12在病毒感染过程中对I型干扰素（IFN-α/β）通路有正向或负向调节作用。在本研究中，我们发现FMDV感染在PK-15细胞早期快速诱导LC3脂质氧化和GFP-LC3亚细胞重新分布。随着感染时间的延长至2-5小时/次，LC3II和ATG5-ATG12水平逐渐降低。进一步研究表明，ATG5-ATG12被病毒蛋白3C降解^{赞成的意见}证明口蹄疫病毒抑制自噬和病毒蛋白的产生。siRNA敲除导致ATG5-ATG12的耗竭显著增加了FMDV的产量，而ATG5-ATM12的过度表达则产生了相反的效果，表明ATG5-ATA12的降解有利于病毒的生长。进一步的实验表明，在口蹄疫病毒感染过程中，ATG5-ATG12的过表达正调节NF-κB通路，显著促进IKKα/β磷酸化和IκBα降解，抑制p65降解，促进p65核转位。同时，ATG5-ATG12还通过阻止TRAF3降解促进TBK1的磷酸化和IRF3的活化。ATG5-ATG12对NF-кB和IRF3通路的正向调节导致IFN-β、趋化因子/细胞因子和IFN刺激基因（包括抗病毒蛋白PKR）的表达增强。总之，上述研究结果表明，ATG5-ATG12在FMDV感染期间积极调节抗病毒NF-κB和IRF3信号，从而限制FMDV的增殖。口蹄疫病毒通过病毒蛋白3C降解ATG5-ATG12的抗病毒功能，形成了对抗ATG5-ATA12抗病毒功能的机制^{赞成的意见}.

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
口蹄疫病毒感染迅速诱导PK-15细胞自噬，自噬随后随着感染时间的推移而受到抑制。(一)口蹄疫病毒感染诱导GFP-LC3斑点。用GFP标记的LC3表达质粒转染PK-15细胞，然后感染FMDV。然后在指定的时间点对细胞进行间接免疫荧光，在共焦显微镜下观察PC3-GFP和FMDV蛋白的信号。绿色信号代表GFP-LC3，红色信号代表FMDV，细胞核用DAPI染色。(b条)FMDV感染后会迅速诱导自噬，并随后随着感染时间的推移而受到抑制。细胞感染FMDV并在指定的时间点采集，然后用指定的抗体进行Western blot分析

图2
口蹄疫病毒通过3C降解ATG5-ATG12抑制自噬^{赞成的意见}. (一)FMDV 3C型^{赞成的意见}负责ATG5-ATG12降级。用载体Flag-L、Flag-2A和Flag-3C质粒转染PK-15细胞。使用anti-Flag、anti-ATG5-ATG12和β-肌动蛋白。(b条)蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂CQ和半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK对3C的影响^{赞成的意见}-诱导ATG5-ATG12降解。用Flag-ATG5-ATG12质粒转染PK-15细胞，并增加Flag-3C的剂量^{赞成的意见}质粒（0，0.25，0.5，1，2 μg），无论是否有MG132（2 μM、 20个 μM），CQ（50 μM、 100个 μM）或Z-VAD-FMK（10 μM、 50个 μM） ●●●●。Flag-ATG5-ATG12和Flag-3C的表达水平^{赞成的意见}用Western blot和反标记检测。(**c（c）**和d日)3C公司^{赞成的意见}直接与ATG5-ATG12相互作用并调节降解。用空载体和Flag-ATG5-ATG12质粒或HA-3C共同转染PK-15细胞^{赞成的意见}质粒和Flag-ATG5-ATG12质粒。24天后对细胞进行裂解 h并用抗HA或抗Flag抗体免疫沉淀，然后进行蛋白质印迹分析。(**e（电子）**)3C公司^{赞成的意见}与ATG5-ATG12共同定位和交互。PK-15细胞与HA-3C共转染^{赞成的意见}或24的Flag-ATG5-ATG12表达质粒 h.用抗Flag（绿色）和抗HA（红色）对细胞进行免疫染色

图3
ATG5-ATG12的过表达降低了FMDV的产量，而ATG5-ATG12的敲除增加了FMDV的产量。(一-**c（c）**)ATG5-ATG12的过度表达抑制FMDV复制。用载体或Flag-ATG5-ATG12质粒转染PK-15细胞24小时 h、其次是FMDV感染（MOI=1），分别为1、3、5和7 小时(一)提取总RNA，通过实时定量RT-PCR分析测定病毒mRNA水平。(b条)蛋白质样本进行Western blot分析，检测Flag-ATG5-ATG12和病毒蛋白VP0、VP1、VP2和VP3的表达。(**c（c）**)收集上清液并进行TCID₅₀病毒滴度测定。(d日-**（f）**)敲除ATG5-ATG12可提高FMDV产量。用对照siRNA（NC）或靶向ATG5和ATG12的siRNA转染PK-15细胞36 h、其次是FMDV感染（MOI=1），分别为1、3、5和7 小时(d日)提取总RNA，通过实时定量RT-PCR分析测定病毒mRNA水平。(**e（电子）**)蛋白质样本进行Western blot分析，检测Flag-ATG5-ATG12和病毒蛋白VP0、VP1、VP2和VP3的表达。(**（f）**)收集上清液并进行TCID₅₀病毒滴度测定。(克)ATG5-ATG12以剂量依赖的方式抑制病毒复制。PK-15（1.2×10⁶增加Flag-ATG5和Flag-ATG12质粒（0、0.25、0.5、1或2）的剂量转染细胞 μg），其次是FMDV感染（MOI=1）5 h.蛋白质样本进行Western blot分析，检测Flag-ATG5-ATG12和病毒蛋白VP0、VP1、VP2和VP3的表达。以上数据代表了三个独立的实验。图表显示平均值±S。D。；n个=3. **P（P）*<0.05; ***P（P）*<0.01

图4
ATG5-ATG12正向调节FMDV诱导的IFN-β和IL-6。(一)ATG5-ATG12过度表达增强干扰素-βmRNA和蛋白质水平的产量。用载体Flag-ATG5和Flag-ATG12质粒转染PK-15细胞24小时 h、接着是FMDV感染（MOI＝1）。在指定的时间点提取总RNA，并提取干扰素-βmRNA定量实时RT-PCR分析。在指定的时间点收集培养基，以量化IFN的分泌-β使用ELISA。(b条)ATG5-ATG12的过度表达在mRNA水平和蛋白质水平上增强了IL-6的产生。实验的执行与(一). 采用实时定量RT-PCR和ELISA检测IL-6 mRNA水平和IL-6分泌。(**c（c）**)敲除ATG5-ATG12可减少IFN-βmRNA水平和蛋白质水平的产量。用对照siRNA（NC）或ATG5-ATG12 siRNA转染PK-15细胞36 h、其次是FMDV感染（MOI=1）。干扰素水平-βmRNA与干扰素的分泌-β分别用实时定量RT-PCR和ELISA检测。(d日)敲除ATG5-ATG12可在mRNA水平和蛋白质水平降低IL-6的产生。实验的执行方式类似于(**c（c）**). 采用实时定量RT-PCR和ELISA检测IL-6 mRNA水平和IL-6分泌。以上数据代表了三个独立的实验。图表显示平均值±S。D。；n个=3. **P（P）*<0.05

图5
ATG5-ATG12正向调节NF-κFMDV感染期间的B p65信号传导。(一)ATG5-ATG12过度表达促进NF-κFMDV感染期间的B信号。用载体Flag-ATG5和Flag-ATG12质粒转染PK-15细胞24小时 h、其次是FMDV感染（MOI=1）。在指定的时间点采集细胞，并制备蛋白质样品。IKK公司α，磷酸化-KKα/β，我κB类α，磷-IκB类α用Western blot分析检测病毒蛋白、p65、phospho-p65、Flag-ATG5-ATG12、ATG5-ATA12和病毒蛋白。(b条)拆除ATG5-ATG12块NF-κFMDV感染期间的B信号。用对照siRNA（NC）或ATG5-ATG12 siRNA转染PK-15细胞36 h、其次是FMDV感染（MOI=1）。在指定的时间点采集细胞并制备蛋白质样品。IKK公司α，磷酸化-KKα/β，我κB类α，磷-IκB类α用Western blot分析检测病毒蛋白、p65、phospho-p65、Flag-ATG5-ATG12、ATG5-ATA12和病毒蛋白。(**c（c）**)ATG5-ATG12的过度表达促进p65核移位。分别用载体Flag-ATG5和Flag-ATG12质粒或ATG5-ATG12 siRNA转染PK-15细胞。模拟感染细胞或用口蹄疫病毒感染5 h.使用针对p65（绿色）和FMDV（红色）的特异性抗体进行免疫染色。细胞核用DAPI染色。(d日)ATG5-ATG12的过度表达促进p65核移位。用Flag-ATG5和Flag-ATG12质粒转染PK-15细胞24小时 h、其次是FMDV感染。制备细胞质和细胞核提取物，并用Western blot分析p65水平。Lamin B1被检测为核部分的负荷控制，并且α-微管蛋白作为细胞质组分的负荷控制。(**e（电子）**)敲除ATG5-ATG12抑制p65核易位。用对照siRNA（NC）或ATG5-ATG12 siRNA转染PK-15细胞36 h、其次是FMDV感染。制备细胞质和细胞核提取物，并用Western blot分析p65水平。Lamin B1被检测为核部分的负荷控制，并且α-微管蛋白作为细胞质组分的负荷控制。以上实验分三次进行

图6
ATG5-ATG12在FMDV感染期间积极调节IRF3信号。(一)在FMDV感染期间，ATG5-ATG12的过度表达促进IRF3信号传导。用载体Flag-ATG5和Flag-ATG12质粒转染PK-15细胞24小时 h、其次是FMDV感染。在0、1、3、5和7时采集细胞 h.p.i.用Western blot分析TRAF3、磷酸-TBK1、IRF3、磷化-IRF3、Flag-ATG5-ATG12、ATG5-ATG13和病毒蛋白的水平。(b条)敲除ATG5-ATG12可降低FMDV感染期间的IRF3信号。用对照siRNA（NC）或ATG5-ATG12 siRNA转染PK-15细胞36 h、其次是FMDV感染。在0、1、3、5和7时采集细胞 h.p.i.用Western blot分析TRAF3、磷酸化TBK1、IRF3、磷化-IRF3、ATG5-ATG12和病毒蛋白水平。以上实验分三次进行

图7
PKR在ATG5-ATG12介导的抗病毒反应中起重要作用。(一)ATG5-ATG12的过度表达可防止FMDV感染期间PKR的降解。用载体Flag-ATG5和Flag-ATG12质粒转染PK-15细胞24小时 h、其次是FMDV感染。在1、3、5和7制备细胞裂解物 h.p.i.，并用抗PKR的蛋白质印迹检测PKR的水平。(b条)敲除ATG5-ATG12可降低PKR蛋白水平。用对照siRNA或ATG5-ATG12 siRNA转染PK-15细胞36 h、其次是FMDV感染。细胞裂解物在1、3、5、7时制备用抗PKR蛋白免疫印迹法检测h.p.i和PKR蛋白水平。(**c（c）**)ATG5-ATG12的过度表达显著增加PKR mRNA转录。实验的执行方式类似于(一)采用实时定量RT-PCR对PKR mRNA进行定量。结果代表了三个独立实验数据的平均值和标准偏差**P（P）*<0.05. (d日)敲除ATG5-ATG12适度抑制PKR mRNA转录。实验的执行方式类似于(b条)采用实时定量RT-PCR对PKR mRNA进行定量。结果代表了三个独立实验数据的平均值和标准偏差**P（P）*<0.05. (**e（电子）**)ATG5-ATG12触发PKR的上调并增加I的磷酸化水平κB.PK-15细胞用载体、Flag-ATG5和Flag-ATG12质粒转染24小时 h、其次是FMDV感染。细胞裂解物在5时制备 h.p.i.和Flag-ATG5-ATG12、PKR、磷酸化-i水平кB类α，我кB类αWestern blot检测病毒蛋白。(**（f）**)敲除ATG5-ATG12降低PKR蛋白表达和I的磷酸化水平κ用对照siRNA或ATG5-ATG12 siRNA转染B.PK-15细胞36 h、其次是FMDV感染。细胞裂解物在5时制备 h.p.i.和ATG5-ATG12、PKR、磷酸化-i水平кB类α，我кB类αWestern blot检测病毒蛋白。(克)PKR在ATG5-ATG12的抗病毒作用中具有重要作用。PK-15细胞与载体和对照siRNA（NC）、标记-ATG5/标记-ATG12和对照siRNA（NC），标记-ATG5/标记-ATG12andPKR siRNA，或载体和PKR siRNA共转染，然后感染FMDV。在1、3、5和7时收获的细胞并用Western blot分析PKR和病毒蛋白水平

图8
ATG5-ATG12参与口蹄疫病毒诱导的IIFN型信号通路的模型。口蹄疫病毒感染可迅速诱导自噬。随后，自噬可能通过FMDV 3C降解ATG5和ATG12而被抑制^{赞成的意见}补充ATG5-ATG12结合物促进IKK的磷酸化α/βI的磷酸化和降解κB类α从而促进p65的核移位。同时，ATG5-ATG12通过稳定TRAF3和增加TBK1和IRF3的磷酸化来增加IRF3活性。此外，ATG5-ATG12还可以阻断FMDV触发的PKR降低，导致p-IkB增加，随后NF活化-κB.然后激活NF-κB和IRF上调kB-依赖基因和I型干扰素的转录

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[3] Klonsky DJ，Emr SD。自噬作为细胞降解的调节途径。科学2000；290: 1717–1721.-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Klonsky DJ，Emr SD。自噬作为细胞降解的调节途径。科学2000；290: 1717–1721.-项目管理咨询公司-公共医学

[5] 水岛N，小松M.自噬：细胞和组织的修复。2011年单元格；147: 728–741.-公共医学

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[9] 谢Z，克林斯基DJ。自噬体形成：核心机制和适应。国家细胞生物学2007；9: 1102–1109.-公共医学

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