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.2017年1月19:8:14098。
doi:10.1038/ncomms14098。

SMARCA4激活突变增加非小细胞肺癌对极光激酶A抑制剂VX-680的敏感性

附属公司

SMARCA4激活突变增加非小细胞肺癌对极光激酶A抑制剂VX-680的敏感性

Vural Tagal公司等。 国家通讯社. .

摘要

SMARCA4/BRG1基因突变导致其蛋白(BRG1)完全丢失,在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中经常发生。目前,没有任何一种治疗药物被确定为对SMARCA4/BRG1丧失具有综合致死性。我们确定AURKA活性在缺乏SMARCA4/BRG1的非小细胞肺癌细胞中至关重要。在这些细胞中,RNAi介导的AURKA缺失或化学抑制在体外和异种小鼠模型中诱导凋亡和细胞死亡。AURKA依赖性、中心体依赖性有丝分裂纺锤体组装所需的圆盘大同源相关蛋白5(HURP/DLGAP5)对SMARCA4/BRG1突变细胞的存活和增殖至关重要,但对SMARCAP/BRG1野生型细胞来说则不然。AURKA抑制剂可能为生物标记物驱动的临床研究提供治疗策略,以治疗含有SMARCA4/BRG1激活突变的非小细胞肺癌。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。NCI-H1819细胞中基于siRNA的全基因组高通量筛选。
()项目流程图。(b条)NCI-H1819细胞不表达SMARCA4。用western blotting方法检测感染pBABE或pBABE-SMARCA4-FLAG的HBEC30-KT、NCI-H1819和NCI-H181的内源性SMARCA4水平和SMARCA4-FLAG的异位表达。(c(c))NCI-H1819细胞中21124个人类基因中每个基因的筛选汇总siRNA结果的示意图。通过CellTiter-Glo分析测定敲除后的细胞活力,该分析测量细胞ATP,作为活细胞的指标。稳健z(z)-计算每个siRNA池三份样本的得分,并使用z(z)-得分<-3被选为具有统计学意义。(d日)每个siRNA池三次生物复制的平均生存能力z(z)-测定得分<-3,并选择生存率<50%的基因进行进一步分析。(e(电子))重新分析了38个不同的毒性点击,30个显著降低了NCI-H1819细胞的活性(P(P)<0.01)与非靶向siRNA相比。图上的误差条是三次生物复制的平均值的标准差*表示统计显著性(P(P)<0.01),**表示统计显著性(P(P)<0.0001)和***表示统计显著性(P(P)<0.0001),并具有较高的生物学意义(生存率<50%)。((f))使用Caspase-Glo 3/7分析法,对13个毒性大于50%的siRNA池和两个对照(PLK1和UBB)进行了三次Caspase 3和/或7激活试验。**表明siRNAs显著(P(P)<0.01)激活半胱天冬酶与非靶向siRNA的比较。其中TPX2和RAN在功能上与AURKA相关,TPX2(白条)是AURKA的直接结合伙伴和激活剂。误差条表示三份生物复制品的标准差。()用裂解PARP和β-肌动蛋白的单克隆抗体对这13个siRNA池进行Western blot分析,通过正交试验证实其中7个siRNA库中存在凋亡反应。PLK1(+)和UBB(+)表明阳性对照是普遍有毒的siRNA。通过单向方差分析和事后(post-hoc)Dunnett的多重比较测试。
图2
图2。TPX2的缺失诱导NCI-H1819细胞凋亡和有丝分裂停滞。
()动画显示TPX2和RAN依次激活AURKA,一种已知的有丝分裂调节器。RAN可以阻止TPX2上Importins的抑制性相互作用,从而激活有丝分裂纺锤体组装的AURKA。(b条)免疫印迹分析证实,转染细胞3天后,四种siRNAs中的三种显著降低了NCI-H1819细胞裂解液中TPX2蛋白的水平。(c(c))用非靶向或单个靶向TPX2的siRNAs转染NCI-H1819细胞五天后,用CellTiter-Glo活性测定法测定细胞活性。PLK1被耗尽作为阳性对照。NT=非目标。**表示统计显著性(P(P)<0.001)。通过单因素方差分析和事后(post-hoc)Dunnett的多重比较测试。(d日)在用非靶向或TPX2靶向siRNA转染细胞3天后,通过单克隆抗体的免疫印迹法检测单个siRNA对NCI-H1819细胞的影响,单克隆抗体用于裂解聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP)、磷酸化H istone H3和β-肌动蛋白作为负荷对照。PARP的裂解表明存在积极的凋亡反应,磷酸化-胆固醇H3表明有丝分裂阻滞。数据代表重复实验。(e(电子))在用非靶向或单个靶向TPX2的siRNAs#5和#6转染NCI-H1819、NCI-1299、NCI-H23、HCC827和Calu-1细胞五天后,用CellTiter-Glo分析测定细胞ATP,作为细胞增殖或存活的替代物。PLK1被耗尽作为阳性对照。图上的误差条是三次生物复制的平均值的标准差。
图3
图3。NCI-H1819中SMARCA4表达缺失会增加siRNAs对AURKA的毒性。
()在用非靶向或AURKA靶向siRNAs转染细胞3天后收集NCI-H1819细胞裂解物,并进行免疫印迹以监测AURQA蛋白水平。(b条)将单个siRNAs转染NCI-H1819细胞五天后,用CellTiter-Glo法对三份生物复制品进行细胞活力测定。PLK1敲除物作为阳性对照。带有s.d.的平均值如图所示。*表示统计显著性(P(P)<0.001),**表示统计显著性(P(P)<0.001),并具有较高的生物学意义(生存率<50%)。(c(c))用单克隆抗体对裂解的PARP、磷酸氢istone H3和β-肌动蛋白进行免疫印迹,以评估AURKA耗竭的反应。(d日)在耗尽NCI-H1819、NCI-H11819-pBABE和NCI-H1829-pBABE-SMARCA4-FLAG细胞中的AURKA五天后,用CellTiter-Glo分析测定细胞活力(b条). (e(电子))用靶向AURKA的非靶向或单个siRNA#28转染NCI-H1819、NCI-1299、NCI-H23、HCC827和Calu-1细胞五天后,用CellTiter-Glo活性测定法测定细胞活性,如图2所示。PLK1被耗尽作为阳性对照。图上的误差条是三次生物复制的平均值的标准差。通过单因素方差分析和事后(post-hoc)Dunnett的多重比较测试。
图4
图4。优先细胞毒性SMARCA4系统-用AURKA抑制剂VX-680处理后的突变细胞。
()用一系列浓度的VX-680处理NCI-H1819和永生化支气管上皮细胞系HBEC30-KT,并用CellTiter-Glo法测定细胞活力。数据是具有s.d的三重生物复制的平均值。一些误差条小于数据符号。(b条)收集26个NSCLC和HBEC株的细胞裂解物,并进行免疫印迹以监测SMARCA4水平。两组免疫印迹均使用SMARCA4-null NCI-H1819和SMARCA4-野生型HBEC30-KT作为对照。(c(c))用VX-680对一组NSCLC和HBEC细胞系进行重复、独立的剂量-反应实验,并显示其个体反应的平均EC50。水平条表示样本组的中位数。(d日)SMARCA4-n完整NCI-H1299细胞和(e(电子))将SMARCA4-wild型HCC827细胞异种移植到NOD/SCID小鼠上。每天两次静脉注射VX-680治疗。对于每个剂量组(n个=4),肿瘤体积平均值和s.e.m.用水平线表示。0的平均值之间差异的重要性毫克公斤−1通过单向方差分析和事后(post-hoc)Dunnett的多重比较测试。
图5
图5。在NCI-H1819细胞中恢复野生型SMARCA4可降低HURP耗竭诱导的细胞毒性。
()用HURP单克隆抗体、裂解PARP(指示凋亡)和磷酸化H istone H3(指示参与有丝分裂的细胞)来测量用四个单独的siRNA池耗尽HURP的反应。(b条)消耗NCI-H1819、NCI-H11819-pBABE和NCI-H1829-pBABE-SMARCA4-FLAG细胞中HURP五天后(c(c))在NCI-H1819、NCI-1299、NCI-H23、HCC827和Calu-1细胞中,如图2和图3所示,使用CellTiter-Glo分析测定细胞活力。PLK1被耗尽作为阳性对照。数据是指具有三次生物复制的s.d.和三次实验的代表性数据。(d日)用针对HURP的单克隆抗体免疫印迹NCI-H1819、NCI-H1819-pBABE和NCI-H1819-pBABE-SMARCA4-FLAG细胞的细胞裂解物。(e(电子))HURP表达在一组SMARCA4系统-免疫印迹法检测突变或野生型NSCLC和HBEC。((f))用ImageQuant软件测量HURP蛋白带强度并绘制图表。水平条表示样本组的平均值和标准偏差。通过单因素方差分析和事后(post-hoc)Dunnet的多重比较测试。
图6
图6。提出了SMARCA4与有丝分裂纺锤体组装机械之间关系的模型。
SMARCA4可能是有丝分裂纺锤体形成中心体依赖途径的关键成分表达所必需的,并抑制纺锤体的中心体诱导依赖途径。当SMARCA4丢失时,肺癌细胞上调HURP并对其耗竭敏感。由于HURP是中心体依赖性通路的一个独特成分,通常对体细胞不敏感,我们推测对Aurora激酶抑制剂的超敏反应与有丝分裂纺锤体形成机制的转换有关。

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引用人

工具书类

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