Gα13 negatively controls osteoclastogenesis through inhibition of the Akt-GSK3β-NFATc1 signalling pathway

doi:10.1038/ncomms13700

.2017年1月19:8:13700。

doi:10.1038/ncomms1370。

Gα13通过抑制Akt-GSK3β-NFATc1信号通路负向控制破骨细胞生成

吴梦瑞¹, 魏晨¹, 云露¹, 朱国春¹, 梁昊¹, 李一平¹

附属机构

PMID： 28102206
预防性维修识别码：项目编号253683
内政部： 10.1038/成本13700

Gα13通过抑制Akt-GSK3β-NFATc1信号通路负向控制破骨细胞生成

吴梦瑞等。国家公社. 2017.

.2017年1月19:8:13700。

doi:10.1038/ncomms1370。

作者

吴梦瑞¹, 魏晨¹, 云璐¹, 朱国春¹, 梁昊¹, 李一平¹

附属

¹美国阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学病理学系，地址：SHEL 810，1825 University Boulevard，Birmingham，Alabama 35294-2182。

PMID： 28102206
预防性维修识别码：项目编号253683
内政部： 10.1038/成本13700

勘误表in

作者更正：Gα13通过抑制Akt-GSK3β-NFATc1信号通路负向控制破骨细胞生成。
吴明、陈伟、陆毅、朱刚、郝立、李永平。 Wu M等人。国家公社。2019年11月25日；10(1):5341. doi:10.1038/s41467-019-13015-6。国家公社。2019 PMID：31767881 免费PMC文章。

摘要

破骨细胞生成的许多阳性信号通路已经被表征，但阴性信号通路的研究较少。在这里，我们通过微阵列和RNAi显示鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α13（Gα13）是破骨细胞生成的负调控因子。破骨细胞介导的Gna13条件敲除小鼠具有严重的骨质疏松症表型。Gna13缺乏通过降低RhoA活性和增强Akt/GSK3β/NFATc1信号，从机制上引发破骨细胞数量和活性的急剧增加（过度激活）。一致地，Akt抑制或RhoA激活挽救Gna13缺陷破骨细胞的过度激活，并且RhoA抑制模拟Gna13缺陷引起的破骨细胞过度激活。值得注意的是，Gα13功能增强抑制Akt活化和破骨细胞生成，并保护小鼠免受疾病模型中的病理性骨丢失。总之，我们揭示了Gα13通过调节RhoA/Akt/GSK3β/NFATc1信号通路，是破骨细胞生成的主要内源性负开关，调控Gα13活性可能是骨疾病的治疗策略。

PubMed免责声明

数字

**图1。由RANKL和M-CSF诱导的Gα13抑制破骨细胞生成。**
(一,b条)破骨细胞分化过程中基因表达的微阵列图谱。OC，破骨细胞；PBM，外周血单核细胞。(**c（c）**)半定量逆转录PCR检测*格纳13*小鼠组织和细胞中的mRNA水平。(d日)定量逆转录-PCR分析*格纳13*，标准化为*Hprt1（小时）*在M-CSF或M-CSF和RANKL治疗的小鼠骨髓单核细胞（BMM）中；N个≥4. (**e（电子）**)Western印迹分析在M-CSF或M-CSF和RANKL治疗下BMM中Gα13的时程表达，并在下图中对其进行定量；N个≥4. (**（f）**)Western blot分析Gα13在非感染BMM（mock）和感染慢病毒的BMM中的表达，慢病毒表达扰乱短发夹RNA（shRNA）（sh-src）或靶向Gna13（shRNA-*格纳13*). (克)TRAP染色检测mock、sh-src和sh破骨细胞的形成-*格纳13*BMM公司。(小时)细胞数量的量化（OC.N/孔和细胞核。N mm⁻²;N个≥10）和相对单元格大小(N个≥100）英寸克.原币。N/孔，每孔破骨细胞（TRAP阳性多核细胞）数量。核。N毫米⁻²，每毫米破骨细胞核数²。中的结果d日,**e（电子）**,小时表示为平均值±标准差***P（P）*≤0.01****P（P）*≤0.001（学生的t吨-测试）。比例尺，200 微米。

**图2。破骨细胞特异性*格纳13*-CKO小鼠表现为骨质疏松。**
(一)定量逆转录-PCR确认缺失*格纳13*mRNA在第1天*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre公司(*f/f；LysM公司*-Cre）和第4天*格纳13*^{飞行/飞行}*Ctsk公司*-克里(*f/f；Ctsk公司*-Cre）前破骨细胞；N个=6. (b条)Western blot证实Gα13蛋白在*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre BMM和第5天*格纳13*^{飞行/飞行}*Ctsk公司*-Cre前破骨细胞。量化在右侧面板中共同呈现；N个=6. (**c（c）**)两个月龄野生型（WT）和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre雄性和雌性小鼠股骨。(d日)两个月大的WT和*Gna13基因*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre雌性小鼠股骨。(**e（电子）**)量化来自d日;N个=6.骨密度，骨密度；BV，骨体积；Tb、。Th，骨小梁厚度；Tb、。N、骨小梁数；Tb、。Sp，骨小梁间隙；电视、纸巾卷。(**（f）**)2个月大的WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre雌性小鼠股骨。(克)高倍图像**（f）**. (小时)N.Oc/BS（破骨细胞数量/骨表面）的量化**（f）**;N个=6. (我)两个月大的WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*Ctsk公司*-雌性小鼠股骨。(j)两个月大的WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*Ctsk公司*-Cre雌性小鼠股骨。(k个)2个月大的WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*Ctsk公司*-Cre雌性小鼠股骨。WT，野生型。结果表示为平均值±标准差**P（P）*≤0.05; ***P（P）*≤0.01; ****P（P）*≤0.001; ns，不显著（学生t吨-测试）。比例尺英寸d日,**（f）**,j,k个，200 微米；比例尺输入克, 20 微米。

**图3。Gα13的缺失促进破骨细胞的形成和功能。**
(一)TRAP染色检测WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-克里(*f/f；LysM公司*-Cre）用M-CSF和不同剂量的RANKL治疗BMM 5天。(b条)细胞数量和相对细胞大小的量化一，等级=10 纳克毫升⁻¹组；N个=6.捕集器⁺MNC，TRAP阳性多核细胞。(d日)定量逆转录-PCR分析*atp6v0d2*,*dc-stamp（直流电源）*,*atp6i*,*nfatc1型*,*ctsk公司*和陷阱以WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre破骨细胞；N个=6. (**e（电子）**)骨载玻片的WGA（小麦胚凝集素）染色和SEM（扫描电子显微镜）分析，以检测骨吸收坑。(**（f）**)骨吸收面积的量化**e（电子）**;N个=6. (克)FITC-WGA染色骨吸收坑的共焦显微镜。(小时)骨吸收坑深度和相对坑大小的量化克ELISA法测定培养基CTX-I（I型胶原羧基末端肽）浓度。(我)成熟破骨细胞F-actin环染色的荧光显微镜。(j)成熟破骨细胞F-actin环（红色）/Ctsk（绿色）/细胞核（蓝色）染色的共焦显微镜。(k个)中F-actin环数的量化我;N个=6. (我)F-actin环体积的量化j;N个=30. (米)Western blot检测细胞内Ctsk蛋白水平及其定量（下表）；N个=3. (n个)Western blot检测培养基中Ctsk的浓度及其定量（右图）；N个=3.结果表示为平均值±标准差**P（P）*≤0.05; ***P（P）*≤0.01; ****P（P）*≤0.001（学生t吨-测试或方差分析）。比例尺英寸一,我,d日，200 微米；比例尺输入克, 5 微米。

**图4。淘汰*格纳13*通过RhoA增强Akt-GSK3β-Nfatc1信号。**
(一)Western blot分析检测RANKL诱导的WT和WT中Akt磷酸化*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre公司(*f/f；LysM公司*-Cre）单核细胞/巨噬细胞。N个=3. (b条)Western blot分析检测M-CSF诱导的WT和WT中Akt磷酸化*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre单核细胞/巨噬细胞。下部面板in一–b条磷酸化Akt水平与Akt总水平的定量；N个=3. (**c（c）**)TRAP染色检测分化过程中不同剂量MK2206 2HCl处理的WT和Gna13缺陷破骨细胞的破骨细胞生成。(d日)TRAP的量化⁺每口井的跨国公司数量**c（c）**;N个=6(**e（电子）**)TRAP的量化⁺每毫米核数²在里面**c（c）**;N个=6. (**（f）**)WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-RANKL和M-CSF刺激后的Cre前破骨细胞及其定量；N个=3. (克)WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-在分化过程中用Rho活化剂II以不同剂量处理Cre破骨细胞。(小时)TRAP的量化⁺每口井的跨国公司数量克;N个=6. (我)TRAP的量化⁺每毫米核数²在里面克;N个=6. (j)WT和*Gna13基因*^{飞行/飞行}*LysM公司*-不同剂量RhoA抑制剂（C3毒素）治疗Cre破骨细胞（0，6，12 纳克毫升⁻¹)在分化过程中。(k个)TRAP的量化⁺每口井的MNC数量j;N个=6. (我)TRAP的量化⁺每毫米核数²在里面j;N个=6. (米)不同剂量Rho活化剂II处理的破骨细胞前体中的Akt磷酸化。(n个)不同剂量C3毒素（0，1，3，6）处理的破骨细胞前的Akt磷酸化纳克毫升⁻¹). 下部面板in米–n个磷酸化Akt水平与Akt总水平的定量；N个=3. (o个)RANKL和M-CSF诱导的GSK3β磷酸化。下面板，定量磷酸化GSK3β水平与总GSK3？水平；N个=3. (第页)WT和WT中NFATc1表达的Western blot分析*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre破骨细胞前体。(q个)WT和WT的细胞核和细胞质裂解物中的NFATc1、GAPDH（细胞质负载控制）和p84（细胞核负载控制）*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre前破骨细胞。右侧面板第页–q个NFATc1水平与负载控制的量化；N个=3.结果表示为平均值±s.d**P（P）*≤0.05; ***P（P）*≤0.01; ****P（P）*≤0.001（学生的t吨-测试或方差分析）。比例尺，200 微米。

**图5。Gα13功能丧失抑制破骨细胞的形成和功能*在体外*.**
(一)TRAP染色检测WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre公司(*f/f；LysM公司*-用过度表达绿色荧光蛋白（GFP）和Gα13CA的慢病毒转染Cre）细胞。(b条)TRAP的量化⁺每毫米MNC数²在里面一;N个=6. (**c（c）**)WGA染色检测WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre细胞过表达GFP和Gα13CA。(d日)每总面积骨吸收面积的量化**c（c）**;N个=6. (**e（电子）**)罗丹明结合磷脂染色检测WT和WT的F-actin环形成*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-用过表达GFP和Gα13CA的慢病毒转染Cre细胞。(**（f）**)中每个视图的F-actin环数量化**e（电子）**;N个=6. (克,我,k个)Western blot检测培养基Ctsk(克)，破骨细胞特异性基因表达(我)RANKL和M-CSF诱导的Akt磷酸化(k个)WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre破骨细胞（GFP或Gα13CA过度表达）。(小时,j,我)蛋白质水平的量化克–我;N个=3. (米,o个)TRAP染色检测BMM破骨细胞生成(米)和RAW264.7电池(o个)转染对照逆转录病毒和过度表达3xFLAG-Gα13CA、AktCA或3xFLAGα13CA+AktCA的逆转录病毒。(n个,第页)TRAP的量化⁺MNC每口井n个,米和中第页,o个;N个=6. (q个,第页)转染对照逆转录病毒和过度表达Gα13CA逆转录病毒的RAW264.7细胞中RANKL诱导的Akt磷酸化的Western blot分析及其定量；N个=3. (秒,t吨)RAW264.7细胞AktCA和Gα13CA过度表达的Western blot证实及其定量；N个=3.EV，空囊泡控制。结果表示为平均值±标准差**P（P）*≤0.05; ***P（P）*≤0.01; ****P（P）*≤0.001（学生的t吨-测试或方差分析）。比例尺，200 微米。

**图6。Gα13保护类风湿性关节炎小鼠免受炎症性骨丢失。**
(一–小时)18周龄雄性WT和hTNFtg类风湿关节炎小鼠脚踝的组织学分析。hTNFtg小鼠脚踝注射AAV-Gα13CA或AAV-YFP。(一)AAV治疗前后的照片。红色箭头显示AAV-Gα13CA治疗后足肿胀减轻。(b条)后爪体积的量化一;N个=8. (**c（c）**,d日)射线照相图像；白色箭头表示骨骼遭到破坏。(d日)骨破坏的量化（Larsen分级）一;N个=8. (**e（电子）**)H&E染色（黑色箭头标记单核细胞浸润）和藏红O（SO）染色（黑色图标标记关节软骨损伤）。(**（f）**)软骨损伤（OARSI分级）和炎症（浸润评分）的量化**e（电子）**;N个=8. (克)TRAP染色；黑色箭头标记TRAP阳性细胞。(小时)破骨细胞数量（Oc.N）的量化克;N个=8.结果表示为平均值±s.d**P（P）*≤0.05; ***P（P）*≤0.01; ****P（P）*≤0.001（学生的t吨-测试）。比例尺英寸**e（电子）**,克200 微米。

**图7。Gα13保护小鼠免受OVX和LPS诱导的骨丢失。**
(一–d日)对注射AAV-YFP或AAV-Gα13CA的13周龄雌性假手术小鼠（对照组）和去卵巢小鼠（OVX）颅骨进行组织学分析。(一)射线照相（较高面板）和μ-CT分析（较低面板）。高清晰度图像同时出现在右角。(b条)骨体积/组织体积定量（BV/TV）；N个=3. (**c（c）**)全颅骨TRAP染色；右侧面板上同时显示了相对TRAP阳性区域的量化；N个=4. (d日)颅骨冰冻切片TRAP染色。破骨细胞定量和骨吸收指标见下表；OC公司。N/B.Pm，每骨周长破骨细胞数；OC公司。N/BS，每骨表面破骨细胞数；ES/BS，每个骨表面的侵蚀表面；N个=4. (**e（电子）**)TRAP染色使用来自8周龄男性WT和*格纳13*^{飞行/飞行}*LysM公司*-Cre公司(*f/f；LysM公司*-Cre）用PBS、LPS、LPS+AAV-YFP或LPS+AAV-Gα13CA处理的小鼠。(**（f）**)骨髓表面和骨髓腔面积TRAP阳性细胞的定量**e（电子）**;N个=6.结果表示为平均值±标准差**P（P）*≤0.05; ***P（P）*≤0.01; ****P（P）*≤0.001（学生的t吨-测试或方差分析）。比例尺一,**c（c）**200 微米；比例尺英寸d日,**e（电子）**, 1 毫米。

**图8。Gα13作为破骨细胞负调控因子的工作模型。**
CNF毒素、Rho激活剂；C3毒素，Rho抑制剂。

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