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.2017年1月18:7:40887。
doi:10.1038/srep40887。

LRRK2突变、衰老和慢性低剂量口服鱼藤酮作为帕金森病模型

刘慧芳 1, 菲利普·温乐浩 1, Gideon Chi-Ting Leung先生 1, 科林·肖志林（Colin Siu-Chi Lam） 1, 雪莉·尹宇鹏 1, 李凌飞 1, 米歇尔·高伟功 1, 大卫·博伊尔·拉姆斯登 2, Shu-Leong Ho公司 1
附属公司

结合LRRK2突变、衰老和慢性低剂量口服鱼藤酮作为帕金森病模型

刘慧芳等。 科学代表. .

摘要

衰老、遗传和环境毒性是帕金森病（PD）的重要病因。然而，其发病机制尚不清楚。一个主要障碍是缺乏一个适当的实验模型，该模型包括遗传易感性、衰老和长期环境毒性。在这里，我们使用突变的LRRK2探索了这些因素之间的相互作用1441G兰特（亮氨酸-丰富-重复激酶-2）敲除小鼠。我们发现突变的初级皮质和中脑多巴胺能神经元更容易受到鱼藤酮诱导的ATP缺乏和细胞死亡的影响。与野生型对照组相比，鱼藤酮中毒后，从年轻突变小鼠分离的纹状体突触体表现出明显的多巴胺摄取降低，这是因为纹状体线粒体和突触囊泡质子泵蛋白（V-ATPase H）水平降低。在50周内每周两次口服鱼藤酮低剂量（寿命的一半）后，突变小鼠在野外试验中比野生型小鼠出现更大的运动障碍。运动障碍的增加与鱼藤酮处理突变体中纹状体线粒体复合物-I（NDUFS4）的特异性降低有关，但在同样处理的野生型小鼠中则没有。我们独特的实验模型将遗传效应、自然衰老和长期的口服环境毒性结合在一起，用于寿命超过一半的突变敲除蛋白LRRK2小鼠，具有可观察和可测量的表型，在进一步研究PD的发病过程和治疗方面具有重要价值。

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数字

图1
图1。LRRK2的细胞活力和ATP水平1441G兰特鱼藤酮暴露后小鼠初级皮层神经元发生突变。
从E14.5突变型LRRK2制备初级皮层培养物1441G兰特和WT小鼠，并用10、25、50、100处理 nM鱼藤酮或载体（DMSO；0.01%培养基）6 小时。（a）在正常未经处理的情况下，WT和突变皮层神经元（DIV7）之间没有观察到形态学差异。比例 = 100 微米。（b）未经处理的WT的基础细胞ATP水平没有显著差异(实线)和突变型(虚线)皮层神经元。（c）在MTT试验中，突变的皮层神经元更容易受到鱼藤酮的剂量依赖性影响，并且（d）ATP耗竭，与鱼藤酮治疗的WT组相比。结果表示为相对于相应的车辆处理控制的百分比。数据代表平均值 ± 三个独立实验的平均值标准误差（SEM）（N = 3). 采用非配对t检验分析各组间的统计显著性*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01.
图2
图2。LRRK2的细胞活力1441G兰特鱼藤酮暴露后突变的小鼠初级多巴胺能神经元。
用5或10 nM鱼藤酮（Rot）或载体（Veh:DMSO；0.01%培养基）48 小时。（a）抗甲状腺激素羟化酶（TH）抗体对多巴胺神经元的免疫染色 nM鱼藤酮。培养物中TH阳性细胞的总数由两名盲人在光学显微镜下独立计数。（b）与同样处理的WT组相比，暴露于鱼藤酮后突变DA神经元的相对存活率显著降低。数据代表平均值 ± 三个独立实验的平均值标准误差（SEM）（N ≥ 3). 通过单向方差分析和Tukey事后检验分析各组之间的统计显著性，***P < 0.001.
图3
图3。鱼藤酮对突触体的影响[三H] -3个月大的小鼠纹状体突触体中DA的摄取以及CoxIV、V-ATP酶H和SV2a蛋白水平的变化。
(一)LRRK2减少更多1441G兰特突变突触体[三H] -100时的DA摄取 nM鱼藤酮与类似处理的WT的比较(重量：7045 ± 583 cpm；突变体：5311 ± 405 中央处理器). 数据表示平均值 ± 来自至少七个独立实验的平均标准误差（SEM）。（b）3月龄小鼠纹状体突触体中CoxIV、V-ATP酶H和SV2a的蛋白表达水平。与WT对照组相比，突变小鼠纹状体突触体总裂解物中的CoxIV和V-ATPase H水平显著降低（N = 6). 使用Student的非配对t检验分析各组之间的统计显著性，*p < 0.05.
图4
图4。LRRK2的运动活性大幅度降低1441G兰特口服鱼藤酮50周后突变小鼠（5 毫克/千克）。
（a）小鼠口服5 鱼藤酮（mg/kg）或载体（4%羧甲基纤维素）每周两次，持续50周，每5周评估一次其运动活性。（b）野外测试运动参数以累积参数时间图表示。每个数据点表示为平均值 ± 平均标准误差（SEM）。三元方差分析表明，LRRK2的组合1441G兰特突变和鱼藤酮处理对移动距离有显著影响（p < 0.01），移动持续时间（p < 0.01）和饲养频率（p < 0.05），鱼藤酮处理的突变小鼠在所有三个参数上的值最低。与同样处理的WT小鼠相比，鱼藤酮处理的突变小鼠的这些参数显著降低（补充表S1-3）。（c、d）鱼藤酮给药50周后，各治疗组的累积移动距离、移动持续时间和饲养频率的梯度。使用Student的非配对t检验分析各组之间的统计显著性，*p < 0.05，**P < 0.01. （车辆处理WT对照组，N = 8; 车辆处理突变体组，N = 6; 鱼藤酮处理的WT组，N = 7; 鱼藤酮处理突变体组，N = 8).
图5
图5
WT和LRRK2黑质致密部（SNpc）和纹状体中酪氨酸羟化酶（TH）的免疫组织化学1441G兰特口服鱼藤酮50周后的突变小鼠。比例 = 150 微米（a）和200 微米（b）WT和突变小鼠鱼藤酮治疗组的SNpc中TH阳性细胞数和纹状体TH染色密度没有显著差异（Student的非配对t检验）。数据表示平均值 ± 三个独立实验的平均值标准误差（SEM）（N = 3).
图6
图6。口服鱼藤酮50周后小鼠纹状体线粒体呼吸复合物I亚单位（NDUFS4）、TH和CoxIV的蛋白表达水平。
鱼藤酮治疗后，突变小鼠的线粒体NDUFS4水平特异性降低，而在那些同样治疗的WT小鼠中没有发现。鱼藤酮治疗后，WT和突变小鼠的TH和CoxIV水平均无显著变化。数据代表平均值 ± 每组至少四只小鼠的平均标准误差（SEM）；使用Student的非配对t检验分析各组间的统计显著性，**P < 0.01.
图7
图7。WT和LRRK2纹状体和皮层中凋亡细胞核的数量1441G兰特口服鱼藤酮50周后的突变小鼠。
(一)低倍率（X40）和（b、c）TUNEL分析后纹状体和皮层区域的高倍（X400）显微照片。TUNEL阳性核(红箭)在WT和突变鱼藤酮处理小鼠的纹状体和皮层中均可见。N个 = 3.规模 = 200 微米（a）和50 微米（b、c）.（d）纹状体和皮层TUNEL阳性细胞的定量(矩形盒子). 对染色纹状体和皮层区域TUNEL阳性细胞数量的统计分析表明，鱼藤酮在WT和突变小鼠中诱导了相似水平的凋亡。数据代表平均值 ± 每组三只小鼠的平均标准误差（SEM）；使用Student的非配对t检验分析各组间的统计显著性，***P < 0.001.
图8
图8。WT和LRRK2 SNpc中凋亡细胞核的数量1441G兰特口服鱼藤酮50周后的突变小鼠。
TUNEL-正极(绿色)TH-阳性(红色)鱼藤酮处理后计数小鼠SNpc区多巴胺能神经元。（a）与相应的载体治疗组相比，50周口服鱼藤酮后，WT和突变小鼠中TUNEL阳性DA神经元的数量显著增加。比例 = 150 微米。(b条)SNpc中TUNEL阳性DA神经元的定量结果。统计分析表明，鱼藤酮诱导WT和突变小鼠的凋亡水平相似。数据代表平均值 ± 每组三只小鼠的平均标准误差（SEM）。使用Student的非配对t检验分析各组间的统计显著性，*P < 0.05.
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