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.2017年3月；140（6）：941-954。
doi:10.1111/jnc.13957。 Epub 2017年2月16日。

溶酶体功能障碍在脂质过氧化产物4-羟基壬醛引起大脑皮层神经元变性中的早期参与

Shi Zhang先生 1, 埃雷斯·埃坦 1, 马克·P·马特森 1 2
附属机构

溶酶体功能障碍在脂质过氧化产物4-羟基壬醛引起大脑皮层神经元变性中的早期参与

Shi Zhang先生等。 神经化学杂志. 2017年3月.

摘要

在急性脑损伤和神经退行性疾病期间，神经细胞会发生自由基介导的蛋白质、脂质和DNA氧化损伤。膜脂质过氧化导致神经元功能障碍和死亡，部分原因是破坏神经元离子稳态和细胞生物能量学。新发现表明，4-羟基壬烯醛（HNE）是一种在脂质过氧化过程中产生的醛，会损害参与神经元稳态的各种蛋白质的功能。在这里，我们检验了HNE损害去除受损蛋白质和细胞器的细胞系统的假设，即大鼠原代皮层神经元的自噬-溶酶体途径。我们发现，HNE在48-72小时内引起细胞凋亡的浓度，分别在暴露后1小时和4小时内增加LC3 II和p62的蛋白水平；6h时，在HNE处理的神经元胞浆中观察到LC3 II和p62免疫反应性斑点。与溶酶体抑制剂bafilomycin A1共同处理对HNE反应中p62和LC3 II上调的程度没有影响，表明HNE对自噬的影响仅次于溶酶体抑制。事实上，我们发现接触HNE的神经元pH值升高，蛋白底物水解和组织蛋白酶B活性降低。暴露于HNE的神经元也表现出K63连接的多泛素化蛋白质的积累，这些蛋白质是溶酶体降解的底物。此外，我们发现接触HNE的神经元中LAMP2a和组成活性热休克蛋白70的水平以及LAMP2a-阳性溶酶体的数量减少。我们的研究结果表明，脂质过氧化产物HNE会导致溶酶体的早期损伤，这可能会导致受损和功能失调的蛋白质和细胞器的积累，从而导致神经元死亡。由于溶酶体功能受损越来越被认为是神经退行性疾病中发生的神经元死亡的早期事件，我们的研究结果表明HNE在这种溶酶体功能障碍中发挥作用。

关键词：细胞凋亡；自噬；脂质过氧化；溶酶体；有丝分裂；泛素。

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利益冲突声明

利益冲突：作者没有要声明的利益冲突。

数字

图1
图1
HNE诱导原代神经元凋亡。在指定的时间段内，将皮层神经元暴露于0.05%乙醇（溶媒对照；Con）或5µM HNE。（A）细胞MTS减少水平（左）和释放到培养基中的LDH水平（右）。（B）图像显示了胭脂红S染色（可染色所有蛋白质）和硝酸纤维素上的HNE免疫反应蛋白。（C–E）在使用载体（Con）或5µM HNE治疗48小时后，用抗裂解caspase-3抗体对神经元进行染色，并用Hoechst进行复染。面板C中显示了具有代表性的图像，面板D和E中显示了核DNA浓缩/碎片化神经元的定量分析结果，以及显示裂解caspase 3免疫反应的神经元的定量结果。结果来自三个独立实验（n=3）中对310个对照神经元和355个HNE处理神经元的分析***p<0.001（学生t检验）。比例尺，20µm。
图2
图2
HNE增加神经元中LC3和p62蛋白水平。（A–C）在指定的时间段内，用0.05%乙醇（Con）或5µM HNE（含或不含100µM巴非霉素A1）处理皮层神经元。使用LC3I/II和p62抗体以及β-肌动蛋白（负载控制）分析神经元细胞裂解物的免疫印迹。面板A中显示了代表性的印迹，面板B和C中显示了LC3II、p62和β-肌动蛋白带的密度分析结果。值（平均值和SEM）来自4个独立的实验。（D–F）使用LC3、p62和β-肌动蛋白抗体对接受指定单独或联合治疗（5µM HNE、100 nM雷帕霉素和100 nM巴非霉素A1）的神经元的总细胞裂解物进行免疫印迹分析。面板D中显示了代表性的斑点，面板E和F中显示了LC3II、p62和β-肌动蛋白带的密度分析结果。值（平均值和SEM）来自4个独立的实验*与对照值相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3
图3
HNE导致神经元中LC3-和p62-免疫活性点的积聚，而不影响生命周期3和第62页mRNA水平。（A）将暴露于乙醇（Con）或HNE 6小时的神经元在−20°C下用100%冷甲醇固定15分钟，然后用抗LC3（绿色）和抗p62（红色）抗体共同染色。核DNA用Hoechst（蓝色）染色。使用40倍物镜和蔡司LSM 410共焦显微镜采集图像。每组代表性神经元（箭头）显示在右侧的高倍图像中。比例尺：左面板50µm，右面板10µm。（B和C）计算每个神经元的LC3-和p62阳性点的数量。结果来自三个独立实验（n=3）中对182个控制神经元和62个HNE处理神经元的分析***p<0.001。（D和E）的级别生命周期3（D） 和第62页（E） 使用实时PCR对乙醇或HNE处理的神经元在指定时间段的RNA样本中的mRNA进行定量。
图4
图4
接触HNE的神经元表现出伴侣介导的自噬标记物水平下降。（A）代表性免疫印迹显示在用0.05%乙醇（Con）处理24小时或5µM HNE处理指定时间段的神经元中LAMP2a和Hsc70的相对水平。（B和C）来自5个单独实验的免疫印迹密度分析结果*p<0.05**p<0.01***与对照值相比p<0.001。（D和E）的级别灯2a（D） 和Hsc70型（E） 使用实时PCR对乙醇或HNE处理的神经元在指定时间段的RNA样本中的mRNA进行定量。
图5
图5
接触HNE的神经元表现出多泛素化蛋白质的积累。（A）典型图像显示暴露于载体（Con）或5µM HNE 6小时的神经元中泛素化蛋白免疫反应。比例尺，10µm。（B）在3个单独的实验中，在对照培养的22个神经元和HNE处理的30个神经元中定量了泛素化蛋白聚集体的点滴***p<0.001。（C、E、I J和K）用乙醇或HNE处理6小时（C、E和G）或24小时（I和K）的神经元总蛋白在4–12%双三凝胶中分离，然后将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。显示了用胭脂红S染色的印迹的代表性实例（左）和用指示抗体免疫反应性的印迹的代表性实例（右）。（D、F、H、J和L）来自3个独立实验的免疫印迹的密度分析结果**p<0.01，***p<0.001。
图6
图6
HNE损害溶酶体功能。（A和B）首先用0.05%乙醇（Con）或100 nM巴非霉素（Baf）处理神经元24小时，或用5µM HNE处理2小时和24小时，然后在LysoSensor绿色溶液中培养5分钟，获得LysoSensur荧光图像。LysoSensor荧光的代表性图像显示在面板A中，每个细胞体的平均荧光像素强度量化结果显示在面板B中（值是在3种不同培养物中对25–35个神经元进行的测量的平均值和SEM。面板A中的比例尺=100µm。（C）用0.05%乙醇（Con）5µM HNE或100 nM bafilomycin A（Baf）处理放置在黑色96 well板中的神经元6小时，然后按照DQ-BSA方案进行处理；荧光强度用平板阅读器定量。（D–I）用0.05%乙醇（Con）5µM HNE或100 nM巴非霉素A（Baf）处理神经元6小时，然后测量组织蛋白酶B和D的酶活性（D和G）和蛋白质水平（E、F、H和I）。数值是在3个单独的实验中测定的平均值和SEM。（J和K）将神经元暴露于指定的单独或联合治疗24小时，并通过MTS（J）和LDH释放（K）分析评估神经元活性。HNE，10µM；Rap:100 nM雷帕霉素；Baf，100 nM巴非霉素A；WRT，5µM沃特曼。数值是在3个独立实验中测定的平均值和SEM。通过Student t检验分析各组之间的差异*与对照值或指示的相邻治疗条件相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
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