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.2017年4月；15(4):814-825.
doi:10.1111/jth.13621。 Epub 2017年2月23日。

重组可溶性apyrase APT102抑制静脉移植物中的血栓形成和内膜增生，而不会对止血或再内皮化产生不利影响

Y Ji先生 1, O阿德奥拉 1, T L斯特朗 1, S S Jeong先生 2, R Chen先生 2, W P Fay公司 1
附属公司

重组可溶性apyrase APT102抑制静脉移植物中的血栓形成和内膜增生，而不会对止血或再内皮化产生不利影响

Y Ji先生等。 J血栓止血. 2017年4月.

摘要

需要新的策略来抑制静脉移植物（VG）中的血栓形成和内膜增生（IH）。我们研究了apyrase（APT102）对VG、平滑肌和内皮细胞（SMC/EC）的影响。APT102抑制血栓形成、SMC迁移和IH，而不影响止血或EC恢复。Apyrase APT102是一种单药方法，用于抑制导致VG失败的多个过程。

总结：背景搭桥术后静脉移植物（VG）因血栓形成和内膜增生（IH）而闭塞是一个主要的临床问题。Apyrase是一种清除细胞外ATP和ADP并促进血管损伤部位腺苷形成的酶，因此具有抑制VG病理学的潜力。目的研究重组可溶性人apyrase（APT102）对体外血小板、平滑肌细胞（SMCs）和内皮细胞（ECs）的影响，以及对小鼠VG血栓形成和IH的影响。方法体外研究SMC和EC的增殖和迁移。将供体小鼠的下腔静脉段移植到受体小鼠的颈动脉。结果APT102能有效抑制ADP诱导的血小板聚集和VG血栓形成，但不影响手术止血。APT102不直接抑制SMC或EC增殖，但显著减弱ATP对SMC和EC增殖的影响。APT102显著抑制SMC迁移，但不抑制EC迁移，EC迁移可能至少部分通过腺苷抑制SMC而非EC迁移来介导。术后4周，经APT102治疗的小鼠VG中的IH明显低于对照组VG。APT102显著抑制VG中的细胞增殖，但不抑制再内皮化。结论全身注射重组人apyrase可抑制VG中的血栓形成和IH，而不会增加出血或损害血管内皮化。这些结果表明，APT102有可能成为一种新型的单药治疗策略，以防止导致VG早期不良重塑和闭塞的多种病理过程。

关键词：腺嘌呤核苷酸；apyrase；冠状动脉搭桥术；新生内膜；静脉血栓形成。

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数字

图1
图1
腹膜内注射后血浆中APT102抗原浓度和ADPase活性。（A–B）单剂量（1.0 mg/kg）给药。在指定的时间点测量APT102抗原（A）和ADPase活性（B）的血浆浓度。（C–D）多剂量给药。每隔一天给药一次APT102（1.0 mg/kg），持续26天，第一次注射指定在第0天进行。在指定的时间点测量APT102抗原（C）和ADPase活性（D）的血浆浓度，在先前注射后24小时（黑圈）或48小时（白圈）采集血液。面板A-D中显示的所有数据点均来自4只小鼠。
图2
图2
APT102抑制静脉移植血栓形成。（A） 小鼠接受静脉移植手术，然后通过腹腔注射接受APT102（n=7）或0.9%NaCl对照（n=6），如方法中所述。术后第6天，局部应用氯化铁诱导静脉移植血栓形成。测量形成闭塞血栓所需的时间*与溶媒治疗对照组相比，P<0.02。（B） 手术后6天，FeCl3在对照（即未经APT102治疗）动物体内诱导血栓的图像。采用Carstairs法对血小板进行灰蓝色染色。血栓中也存在一些白细胞（较大的红色细胞）。白色箭头表示移植静脉壁和腔内血栓的界面。比例尺=50µm。
图3
图3
APT102抑制血小板聚集而不影响手术止血。（A） 通过外科冲洗液的分光光度分析评估外科伤口出血量（较高的吸光度表明血红蛋白含量较高），APT102组与对照组之间无显著差异（P>0.4；n=6/组）。（B） 添加ADP（5µM）后5分钟评估血小板聚集率*P<0.01；n=3/组。（C） 用APT102处理的小鼠和对照小鼠富含血小板血浆样品的代表性血小板聚集曲线。箭头表示添加ADP。（D） APT102不影响凝血酶原时间（PT）。将APT102添加到混合柠檬酸血浆中，以达到3 mg/L的浓度。添加等量的TBS以控制混合血浆。所示数据代表5个实验的结果。
图4
图4
APT102无细胞毒性，可阻断外源性ATP对平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞（EC）增殖的影响。（A–B）APT102不影响SMC或EC增殖。箭头表示细胞在介质交换期间暴露于APT102（10µM）新鲜制剂的时间点。（C–D）在细胞培养2天后（C）和4天后（D）评估ATP（10µM）和ATP+APT102（分别为10µM和100 nM）对SMC增殖的影响。（E–F）细胞培养2天后（E）和4天后（F）评估ATP（10µM）和ATP+APT102（分别为10µM和100 nM）对EC增殖的影响*与对照组相比，P<0.05。数据来自SMC的四份实验和EC的三份实验。
图5
图5
APT102抑制血管平滑肌细胞（SMC）迁移，但不抑制内皮细胞（EC）迁移。（A） 将人冠状动脉平滑肌细胞（黑条）或人主动脉内皮细胞（白条）接种在跨腔（5×10）的上腔4细胞/孔）。将ATP（10µM，+）或载体对照（−）添加到下腔培养基中；将APT102（100 nM，+）或车辆控制（−）添加到上下室介质中。培养6小时后评估细胞迁移。数据来自SMC的6个独立实验和EC的4个独立实验，表示为相对细胞迁移（增加或减少倍数）与对照（无APT102或ATP=条的最左侧直径）*与对照组SMC相比P<0.05；†与对照组相比P<0.05；‡P> 0.6 vs.仅用APT102治疗的SMC。（B） 迁移细胞的代表性图像。放大20倍。
图6
图6
腺苷对平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞（EC）迁移以及SMC和EC表达CD73的影响。（A） 腺苷抑制SMC迁移*与对照组相比，P<0.02。（B） 腺苷不抑制EC迁移。（C） SMC和EC表达CD73 mRNA。RT-PCR产物显示，RNA来源（“-”表示无）和反应混合物中存在（+）或不存在（-）逆转录酶（RT）。（D） 定量实时RT-PCR数据。各组间CD73基因表达差异无统计学意义（P>0.5）。数据表示三个重复的实验。
图7
图7
APT102抑制静脉移植物内膜增生。小鼠接受静脉移植手术，并用APT102或对照药物治疗2周。术后4周采集静脉移植物并进行分析。（A–D）初始实验，在TBS（n=7只小鼠）中注射APT102（1 mg/kg/支），对照注射包含0.9%（n=8只小鼠）。（A） Intima地区；（B） 管腔狭窄（%）；（C） 血管总截面积；（D） 静脉移植的典型图像。（E–H）随访实验，涉及相同的方法，除了APT102以1和2 mg/kg/次注射的剂量在TBS中注射（每个剂量n=5只小鼠），对照注射由TBS组成（n=5小鼠）。（E） 内膜区；（F） 管腔狭窄（%）；（G） 血管总截面积；（H） 静脉移植的典型图像*与对照组相比P<0.05；N.S.=与对照组相比无显著差异；†P> 0.6 vs.APT102 1 mg/kg。比例尺=50µm；箭头指示内膜和中膜之间的边界；L=流明。
图8
图8
APT102抑制静脉移植物中的细胞增殖，但不抑制再内皮化。（A） 细胞增殖数据。术后28天从接受APT102（1 mg/kg/次注射）或0.9%NaCl对照的小鼠中取出静脉移植物，进行增殖细胞核抗原（PCNA）免疫染色。免疫染色定量如图所示（n=6只小鼠/组；*与对照组相比P<0.03）。显示每组一只老鼠的代表性图像（棕色=PCNA）。（B） 重新加密数据。术后28天采集静脉移植物，用抗CD31抗体免疫荧光显微镜检测内皮细胞。EC免疫染色定量如图所示（n=5只小鼠/组；组间差异无统计学意义，P>0.8）。显示了每组中一只鼠标的代表性图像。箭头表示CD31-阳性EC（红色）。PCNA和CD31免疫染色的细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染成蓝色。L=流明。比例尺=50µm。
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