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.2017年1月10日;13(1):e1006535。
doi:10.1371/journal.pgen.1006535。 eCollection 2017年1月。

GGPP介导的卵母细胞蛋白香叶基化对建立小鼠卵巢卵母细胞-颗粒细胞通讯和初级-次级卵泡转变至关重要

附属公司

GGPP介导的卵母细胞蛋白香叶基化对建立小鼠卵巢卵母细胞-颗粒细胞通讯和初级-次级卵泡转变至关重要

陈江等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

卵泡发生是一个进行性和高度调控的过程,为以后的生殖生活提供卵子至关重要,需要卵母细胞和颗粒细胞之间的双向通讯。这种物理连接介导的通信不仅将卵母细胞的信号传递给颗粒细胞,以调节其增殖,还将颗粒细胞的代谢物传递给卵母细胞进行生物合成。然而,建立这种沟通的基本机制在很大程度上是未知的。在这里,我们报道了卵母细胞香叶基香叶基二磷酸(GGPP),一种参与蛋白香叶基化的代谢中间体,是建立卵母细胞-颗粒细胞通讯所必需的。卵泡发育早期,卵母细胞中的GGPP和香叶基香叶基二磷酸合成酶(Ggpps)水平升高。小鼠卵母细胞中GGPP的选择性耗竭损害了颗粒细胞的增殖、初级-次级卵泡转变和雌性生育能力。从机制上讲,GGPP耗竭抑制了Rho-GTPase香叶基香叶基化及其GTPase活性,这是卵母细胞细胞质中细胞连接蛋白积累以及卵母细胞和颗粒细胞之间无法保持物理连接的原因。GGPP消融还阻断了Rab27a香叶基香叶酰化,这可能是导致Gdf9等卵母细胞物质分泌受损的原因。此外,GGPP给药恢复了Ggpps耗竭小鼠卵母细胞-颗粒细胞接触、颗粒细胞增殖和初级-次级卵泡转变的缺陷。我们的研究证明,GGPP介导的蛋白香叶基香叶酰化有助于建立卵母细胞-颗粒细胞通讯,进而调节初级-次级卵泡转变,这是卵泡发生的关键阶段,对女性生殖功能至关重要。

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数字

图1
图1。Ggpps主要在卵母细胞中表达,并与早期卵泡发育相关。
(A) 免疫组织化学检测PD4(原始卵泡和初级卵泡)和PD23(腔前卵泡和窦前卵泡)小鼠卵巢切片中Ggpps的表达。阴性对照涉及初级抗体阶段的异常。箭头表示卵泡的不同阶段。比例尺,100μm。(B) 对PD 2(指示原始卵泡)、PD 6(指示初级卵泡)和PD 12(指示次级卵泡)小鼠卵巢进行Western blot分析。肌动蛋白和GAPDH被用作内部负荷控制。(C) Western blot分析大于或小于25μm卵母细胞中Ggpps蛋白水平。肌动蛋白被用作内部负荷控制。数据以平均值±SEM表示。*p<0.05,**p<0.01。
图2
图2。卵母细胞特异性GGPP缺失会损害卵泡发育和女性生育能力。
(A) 雌性累计产仔数的比较全球生产总值飞行/飞行Ddx4-Core和CTL小鼠。(B和C)6周龄卵巢的形态、大小和重量全球生产总值飞行/飞行Ddx4-Core和CTL小鼠。比例尺,250μm。(D) 6周龄卵巢的H&E染色。比例尺,250μm。数据表示为平均值±SEM。**p<0.01。
图3
图3。卵母细胞GGPP缺失抑制卵巢初级-次级卵泡转变。
(A) 指定时间点的卵巢重量(n=3-6)。(B) 使用光学显微镜拍摄不同时间点的卵巢图像。PD 3和PD 23卵巢(C和D)MVH免疫荧光和原始卵泡数(n=4)全球生产总值飞行/飞行Ddx4-Core和CTL小鼠。DAPI(蓝色)表示细胞核。在指定的时间点对卵巢进行(E-G)H&E染色,并对PD 8、PD 10和PD 13小鼠卵巢中观察到的不同类型的卵泡进行量化,包括原始卵泡(Pri)、初级卵泡(Pr)、4型卵泡(T4)和5型卵泡。每个卵巢的卵泡数按照材料和方法中的描述进行量化(n=4)。箭头表示卵母细胞和颗粒细胞之间的异常接触。数据以平均值±SEM表示。*p<0.05,**p<0.01。比例尺,200μm。
图4
图4。卵母细胞中GGPP的缺失通过抑制卵母细胞因子的分泌来阻止颗粒细胞增殖。
(A和B)Ki67免疫荧光分析和PD13卵巢中Ki67阳性颗粒细胞的定量全球生产总值飞行/飞行、Ddx4-Core和CTL小鼠。比例尺,25μm。(C和D)PCNA免疫组化和PD13卵巢中PCNA阳性颗粒细胞的定量。比例尺,25μm。每个初级卵泡中Ki67阳性和PCNA阳性颗粒细胞的数量按照材料和方法中的描述进行量化(n=4)。(E) PD12–14卵巢分离颗粒细胞激活Smad2的Western blot分析。(F) 定量PCR(qPCR)分析Gdf9型百万分之十五PD 8卵巢中的表达。(G) PD 8卵巢Gdf9蛋白的蛋白质印迹分析。肌动蛋白被用作内部负荷控制。对照生长卵母细胞与PD 12–14共同培养全球生产总值飞行/飞行,Ddx4-Core颗粒细胞。培养24小时后,用western blot(h)评估颗粒细胞裂解液中的p-Smad2和Smad2水平,在分离的颗粒细胞(I)中测量Ki67免疫荧光。比例尺,50μm。(J) PD 12–14卵巢中Rab27a的戊二醛化。(K) 采用Triton X-114分离法对PD 12–14卵巢中的Rab27a进行亚细胞分离。上水相(向上)含有水溶性小GTPases,下有机相(向下)含有脂溶性小GTPases。数据表示为平均值±SEM。**p<0.01。
图5
图5。卵母细胞中GGPP的缺失抑制了卵母细胞和颗粒细胞之间的物理联系。
(A) PD 13卵巢的透射电镜分析。初级卵泡中的红色箭头表示颗粒细胞(gc)和卵母细胞(o)之间的透明带。黑色箭头表示缝隙连接。白色箭头表示自噬体。Mi,线粒体。(B)使用PD 8卵巢的裂解物对N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白,连接蛋白37和连接蛋白43进行蛋白质印迹分析。肌动蛋白和GAPDH作为内负荷对照。(C-E)β-连环蛋白和N-钙粘蛋白免疫荧光以及PD13卵巢原始卵泡和初级卵泡中卵母细胞和颗粒细胞之间粘附的定量。按照材料和方法(n=4)评估细胞粘附性。数据以平均值±SEM表示。*p<0.05,**p<0.01。比例尺,25μm。
图6
图6。GGPP缺失通过抑制Rho-GTPase香叶基香叶酰化和GTPase活性,干扰钙粘附素介导的细胞接触。
(A) PD12-14卵巢中Rac1、RhoA和Cdc42的酶活性。(B) PD 12-14卵巢中Rac1和RhoA的丙烯基化。(C) 采用Triton X-114分离法对PD 12–14卵巢中Rac1和RhoA进行亚细胞分离。水上相含有水溶性小GTPases,下有机相含有脂溶性小GTPases。(D) 使用超速离心法测定PD 12-14卵巢中Rac1和RhoA膜的结合。(E) 通过GGPP治疗(20μM,24 h),在器官培养的PD 12-14卵巢中Rac1丙烯基化。(F) 每日腹腔注射GGPP(2 mg/kg)5天后,PD 13卵巢初级卵泡中的β-catenin免疫荧光。(G) 每日腹腔注射GGPP(2 mg/kg)5天后,Ki67免疫荧光、H&E染色(H)、PD13卵巢T4卵泡定量(I)和卵巢重量(J)。数据以平均值±SEM表示。*p<0.05,**p<0.01。
图7
图7。GGPP介导的蛋白香叶基香叶基化的示意图,涉及通过重塑卵母细胞-颗粒细胞通讯调节初级-次级卵泡过渡。
胆固醇由甲羟戊酸途径的代谢中间产物法尼基二磷酸(FPP)生物合成。通过香叶基香叶基二磷酸合成酶(GGPPS),FPP可以被催化成另一种代谢产物香叶基香叶基二磷酸(GGPP)。然后使用GGPP进行香叶基香叶酰化,并激活Rho GTPase和Rab GTPase。激活的Rho GTPase负责卵母细胞膜中细胞连接蛋白的定位,以维持卵母细胞与颗粒细胞之间的物理连接。激活的Rab GTPase可能解释了Gdf9等卵母细胞物质的分泌。这两个过程可能对颗粒细胞从一层增殖到多层,并最终促进初级-次级卵泡的转变很重要。盒子中的通路可能主要发生在颗粒细胞中。虚线箭头描述了GGPP调节的小GTPase对卵母细胞-颗粒细胞通讯的可能机制。

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这项工作得到了国家自然科学基金(批准号:31530046和31271540,http://www.nsfc.gov.cn,至CJL)。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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