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.2017年1月4:8:14058。
doi:10.1038/ncomms14058。

VGLL4靶向TCF4-TEAD4复合物，协同调节结直肠癌中Wnt和Hippo信号

石蛟 1, 李传川 1, 钱浩 1, 苗浩飞 1, 张磊（Lei Zhang） 1 2, 林莉（Lin Li） 2 三, 周兆才 1 2
附属公司

VGLL4靶向TCF4-TEAD4复合物，协同调节结直肠癌中Wnt和Hippo信号

石蛟等。 国家公社. .

摘要

多种信号通路的协同共同调节对组织同型性和肿瘤发生至关重要。在这里，我们报告了VGLL4，一种先前确定的YAP拮抗剂，也作为Wnt/β-catenin信号的调节器发挥作用。临床结直肠癌（CRC）标本中VGLL4的表达显著下调，与患者生存率呈正相关，与CRC中Wnt靶基因的表达呈负相关。VGLL4的敲除增强CRC细胞的增殖和肿瘤形成。设计的模拟VGLL4功能的肽在新生小鼠模型中有效抑制CRC进展。从机制上讲，TEAD4与TCF4结合形成一个复杂的协同靶基因。VGLL4以TEAD4-TCF4复合物为靶点，干扰TEAD4和TCF4之间的功能相互作用，抑制TCF4的反式激活。总之，我们的研究表明Wnt/β-catenin和Hippo-YAP信号在转录因子水平上直接相连，VGLL4可以靶向TEAD4-TCF4复合物来共同调节这两种途径。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者就VGLL4在CRC治疗中的潜在应用申请了专利。

数字

图1
图1。CRC样本中VGLL4水平降低。
(一)组织芯片上VGLL4染色的代表性图像。比例尺表示100 微米。(b条)正常和癌变结肠组织的VGLL4染色水平显示阴性（−）、弱（+）、中度（++）、强（+++）VGLL3表达水平。(c（c）)本文分析了5例结直肠癌及其邻近正常组织中VGLL4蛋白的水平。(d日)Kaplan-Meier生存分析(n个=226）或低(n个=106）使用logrank检验从GSE14333数据集获得的VGLL4 mRNA水平。根据Kaplan–Meier方法计算生存曲线。P（P）<0.05表示存在显著差异。另请参见补充图1。
图2
图2。VGLL4的下调与Wnt靶基因的上调相关。
(一)VGLL4型大肠癌mRNA水平。采用实时荧光定量PCR技术检测30对人结直肠癌组织和正常组织中VGLL4 mRNA的水平GAPDH公司作为内部控制。每个条的值显示了VGLL4型正常组织中的信使核糖核酸水平和肿瘤中的信使核糖核酸水平，由方程Δ表示计算机断层扫描(N个)−Δ计算机断层扫描(T型)：值>1表示VGLL4型肿瘤中的mRNA水平增加，值<-1表明VGLL4型肿瘤中mRNA水平降低。实验重复了两次。配对t吨试验用于比较配对肿瘤和正常组织。(b条——d日)大肠癌组织中Wnt靶基因的mRNA水平。相对mRNA水平轴2(b条),CCND1号机组(c（c）)和c-MYC公司(d日)进行了分析。实验重复了两次。配对t吨进行了测试。(e（电子）)的方框图VGLL4型和Wnt靶基因水平在不同肿瘤阶段。数据表示为中位数和四分位数范围。实验重复了两次。未付款t吨进行了测试*P（P）<0.05，与对照组相比显著。(（f）)散布图介于VGLL4型和CCND1号机组CRC样本中的mRNA水平。VGLL4型表达与CCND1号机组通过应用斯皮尔曼相关性。实验重复两次（补充图2）。
图3
图3。VGLL4抑制Wnt/β-catenin信号传导。
(一)VGLL4以剂量依赖性的方式抑制Wnt3a处理的HEK293T细胞的TOP-FLASH活性。(b条)VGLL4抑制Wnt3a处理的HEK293T细胞中Wnt靶基因的转录。(c（c）,d日)敲除VGLL4促进TOP-FLASH活性(c（c）)Wnt靶基因的转录(d日)在HEK293T细胞中。(e（电子）)VGLL4抑制HCT116和SW480细胞中的TOP-FLASH活性。(（f）)VGLL4抑制HCT116和SW480细胞中Wnt靶基因的转录。(克,小时)敲低VGLL4促进TOP-FLASH活性(克)Wnt靶基因的转录(小时)HCT116和SW480细胞中。(我)转染VGLL4或shVGLL后HCT116细胞Wnt靶基因转录的微阵列分析。VGLL4负调控的基因以黑点标记；而VGLL4正调控的基因以灰点标记。注：中的数据一——小时表示平均值±S。D.来自一个实验。我们重复了三次实验。未付款t吨测试用于比较各组之间的差异*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，与对照组相比显著。无统计学意义；ctrl，控制向量（下同）；scr，加扰shRNA（如下所示）（补充图3-5）。
图4
图4。VGLL4抑制Wnt信号依赖于TEAD4-TCF4的相互作用。
(一)人类TEAD4领域组织的示意图。氨基酸编号根据人类TEAD4。(b条,c（c）)结合TEAD缺陷的VGLL4突变体（HF4A）未能抑制TOP-FLASH活性(b条)Wnt靶基因的转录(c（c）)在用Wnt3a处理的HEK293T细胞中。(d日,e（电子）)VGLL4突变体（HF4A）没有抑制TOP-FLASH活性(d日)Wnt靶基因的转录(e（电子）)HCT116细胞中。(（f）)敲除TEADs（TEAD1，2，3，4）抑制Wnt3a处理的HEK293T细胞中的TOP-FLASH报告活性。(克,小时)染色质用TEAD4抗体免疫沉淀(克)或TCF4抗体(小时)然后使用跨越人类Axin2基因座的引物对进行qPCR。结果显示为输入的免疫沉淀百分比，是三个独立实验的代表。(我,j个)ChIP-qPCR显示TCF4/TEAD4与Axin2启动子结合，293T细胞转染了对照siRNA、TCF4 siRNA（siTCF4s）或带有TCF4抗体的TEAD siRNAs（siTEAD）(我)或TEAD4抗体(j个).注：中的数据b条——j个表示一个实验的平均值±标准差。我们重复了三次实验。未付款t吨测试用于比较各组之间的差异*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，与对照组相比显著。不另作说明，无统计意义。HF4A是一种VGLL4突变体，其中氨基酸H212、F213、H240和F241被丙氨酸取代。GFP-TEA，GFP标记的TEAD4 TEA结构域（补充图6）。
图5
图5。TEAD4和TCF4形成一个复合物，用于联合靶基因。
(一)免疫共沉淀法分析TEAD4和TCF4的相关性。HEK293T细胞经Wnt3a或不经Wnt2a处理4次 h.然后将细胞裂解物与抗TCF4抗体或对照IgG孵育并免疫沉淀。(b条)Co-IP分析，以确定TEAD4和TCF4与DNA酶或不与DNA酶的相互作用。用琼脂糖凝胶监测DNA的消化。(c（c）)使用纯化的重组蛋白（含或不含SOX2启动子DNA片段）进行下拉试验，以检测TEAD4-TCF4相互作用。(d日——（f）)使用纯化的重组蛋白对TCF4和TEAD4之间的相互作用进行生物层干涉分析。(d日)全长TEAD4（芯片上包被）可以与GST标记的全长TCF4或GST标记的TCF4（氨基酸326–411）结合，但不能与GST标记的TCF（氨基酸8–54）或GST结合。(e（电子）)全长TCF4（芯片上涂层）可以绑定到TEA域，但不能绑定到TEAD4的YBD。(（f）)TCF4（氨基酸326–411）（涂敷在芯片上）可以以剂量依赖的方式与TEAD4的TEA结构域结合。(克)凝胶过滤分析含或不含SOX2 DNA的VGLL4、TEAD4、TCF4和β-catenin之间的相互作用。(小时)TCF4与TEAD4和DNA复合物相互作用的结构建模。(我,j个)TEAD4 TEA结构域的过度表达消除了VGLL4介导的TOP-FLASH报告活性抑制(我)Wnt靶基因的转录(j个)HCT116细胞中。中的数据我和j个表示一个实验的平均值±标准差。我们重复了三次实验。未付款t吨测试用于比较各组之间的差异*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，与对照组相比显著。不另作说明，无统计意义。
图6
图6。VGLL4抑制结直肠癌细胞生长。
(一)VGLL4抑制HCT116细胞和SW480细胞的增殖。(b条)VGLL4抑制HCT116和SW480细胞的集落形成。比例尺表示10 毫米(c（c）,d日)shVGLL4#1敲低内源性VGLL4促进异种移植瘤生长。老鼠被杀后被拍照。黑色条表示一个实验的平均值。比例尺表示10 毫米(c（c）)在进一步处理之前，对每只小鼠的肿瘤进行拍照。(d日)测量每组小鼠（10只小鼠）的肿瘤体积。(e（电子）)面板d样本中Wnt靶基因的mRNA水平。注：数据一,b条,d日和e（电子）来自一个实验。我们重复了两次实验。未付款t吨测试用于比较各组之间的差异*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，与对照组相比显著。不另作说明，无统计意义。
图7
图7。空气污染指数最小值/+小鼠对Super-TDU治疗敏感。
(一)描述治疗过程的图表空气污染指数最小值/+使用Super-TDU的小鼠。空气污染指数最小值/+和同窝野生型(空气污染指数+/+)小鼠（4周龄）随机接受500只 微克 公斤−1(n个=10）每天通过尾静脉注射Super-TDU肽或对照肽（n=10）。此外，其他小鼠接受50 毫克 公斤−1静脉注射5-氟尿嘧啶（5-FU）作为阳性对照(n个=10). 8周后，处死12周龄的小鼠，并提取其肠道（小肠和结肠）。(b条)整个小肠的照片显示有大肠肿瘤。箭头表示腺瘤。比例尺表示1 毫米(c（c）——e（电子）)肿瘤数量(c（c）)，肿瘤数量（长度>5 毫米）(d日)和肠道长度(e（电子）)进行了计算。数据来自一个实验。我们重复了两次实验。未付款t吨测试用于比较各组之间的差异。(（f）)野生型（WT）肠组织Ki67染色空气污染指数最小值/+用对照、Super-TDU或5-FU处理的小鼠。在各组下方标记Ki67阳性细胞的百分比。比例尺表示50 微米。(克)Wnt靶基因在野生型（WT）肠组织中的相对表达空气污染指数最小值/+用对照组、Super-TDU或5-FU治疗的小鼠。(小时)小鼠存活曲线。请注意，所有小鼠在治疗的前25天都存活了下来，所有接受Super-TDU治疗的WT小鼠以及接受对照的WT鼠在整个治疗期间都存活了。数据来自一个实验。实验重复了两次。生存曲线根据Kaplan–Meier方法计算；使用logrank检验进行生存分析*P（P）<0.05，与对照组相比显著。注：数据位于c（c）——e（电子）和克来自一个实验。实验重复了两次。未付款t吨测试用于比较各组之间的差异*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，与对照组相比显著。不另作说明，无统计学意义（补充图7和8）。
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