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.2016年12月29日；11（12）：e0168988。
doi:10.1371/journal.pone.0168988。 2016年eCollection。

Temsirolimus部分拯救Hutchinson-Gilford Progeria细胞表型

戴安娜·加布里埃尔 1, 莱斯利·B·戈登 2 3, 卡里马·贾巴利 1
附属公司

Temsirolimus部分拯救Hutchinson-Gilford Progeria细胞表型

戴安娜·加布里埃尔等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

Hutchinson-Gilford综合征（HGPS，OMIM 176670，这是一种罕见的早衰症，可导致平均14.7岁的人死于心肌梗死或中风，是由LMNA基因突变引起的。除了调节DNA复制、DNA转录、增殖和分化外，层压板还有助于维持核膜的形状和稳定性LMNA突变导致前胺A羧基末端区域50个氨基酸缺失，产生截短的法尼基化蛋白前体。前体蛋白在HGPS细胞核中的积累导致许多形态和功能变化，导致细胞过早衰老。逆转这种HGPS表型的尝试已确定雷帕霉素是一种雷帕霉素哺乳动物靶向抑制剂（mTOR），是一种能够通过促进自噬和减少前体蛋白积累来拯救HGPS细胞表型的药物。雷帕霉素是治疗HGPS疾病的明显候选药物，但临床上很难使用。为了进一步评估雷帕霉素在蛋白质平衡、线粒体功能和DNA损伤程度方面的功效，我们测试了替米罗莫司，这是一种雷帕霉素类似物，其药代动力学特征优于雷帕霉素。我们报告称，替米罗莫司降低前体蛋白水平，增加增殖，减少畸形细胞核，部分改善DNA损伤，但不改善蛋白酶体活性或线粒体功能障碍。我们的研究结果表明，未来的治疗策略应该确定新的药物组合和治疗方案，以针对HGPS细胞的所有功能失调特征。

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利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。替姆西莫司通过自噬增加孕激素清除率。
（A） 对照组（GMO3349C）和HGPS（HGADFN 003，HGADFN127）成纤维细胞的典型Western blot，这些成纤维细胞经过模拟处理或Temsirolimus处理（Tem）9天。使用针对所示蛋白质的抗体（S6RP、pS6RP、4EBP1和p4EBP）。（B） 对照组（GMO3349C，GMO1651C）和HGPS（HGADFN003，HGADFN227）细胞中p4EBP1的定量，用载体或1μM替米司莫司处理9天（n=3），并归一化为β-肌动蛋白。水平表示为相对于对照细胞的折叠表达。（C） 用与（A）中相同的细胞对自噬体进行免疫荧光染色。MDC（单dansylcadaverin）染色的自噬体，而碘化丙啶被用作细胞死亡的标记物。三苯氧胺作为阳性对照。（D） 使用与（A）中相同的细胞和培养条件来测量自噬，如方法中所述。数据表示为平均值±S.D.（*p值≤0.05；n=5）。（E） HGPS裂解产物的典型western blot。用1.0μM替米罗莫司或1.0μM替米罗莫斯与MG132（MG）或氯喹（Cq）模拟处理或处理细胞。左面板：检测泛素的Western blot。右侧面板：Western blot检测所示蛋白层粘连蛋白A/C、p62、LC-3B-I和II以及β-肌动蛋白（n=3）的特异性抗体。（F） 使用与（E）中所述相同的细胞和培养条件的代表性western blot。左侧面板对应于western blot的Ponceau-S红色染色。右图：用所示蛋白前体蛋白和β-肌动蛋白（n=3）的特异性抗体进行Western blot检测。前体蛋白带上方的数字表示折叠表达。（G） 用蛋白质印迹法测定各组（F）中抗前体抗体分析的每个样本中前体蛋白的折叠表达，并将其归一化为β-肌动蛋白。水平表示为相对于模拟处理对照细胞的折叠表达（*p值≤0.05；n=5）。
图2
图2。Temsirolimus改善HGPS细胞的层粘连状态和核形状。
（A） 对照组和HGPS总细胞提取物中的层粘连蛋白A/C、前体蛋白和β-肌动蛋白的典型Western blots，从模拟处理的细胞或每天用1.0μM替米罗莫司处理的细胞中分离，持续9天。（B） 在面板（A）中使用抗层粘连蛋白A/C抗体进行免疫印迹分析，并将其归一化为β-an-肌动蛋白（*p值≤0.05；n=5），测定每个样本的层粘连蛋白质A、前体蛋白和层粘连蛋白酶C的折叠表达。（C） 用载体或1.0μM替米司莫司治疗9天后畸形细胞核（畸形）的频率。每个条件下平均检查900个细胞核，每个实验重复3次。（D） 9天后，使用针对指定蛋白（层粘连蛋白A/C、前体蛋白和层粘连B1）的抗体，对模拟处理或Temsirolimus处理的对照（GMO3349C）和HGPS（HGADFN003）成纤维细胞进行免疫化学。显示了具有代表性的图像（n=4）。标尺：20μm。
图3
图3。在长期治疗期间，替米罗莫司进一步增强了前体激素清除。
（A） 按照对照组和HGPS成纤维细胞方法中的规定，计算每个指定日期的累积群体倍增。细胞要么模拟处理（载体DMSO），要么用1.0μM替米罗莫司处理。（B） 对照细胞和HGPS细胞的活性测定，模拟处理或用替米莫司处理9天和21天。按照材料和方法中的规定进行测定。添加胰蛋白酶作为阳性对照。数据表示为平均值±S.D.（*p值≤0.05；n=4）。（C） 通过b-半乳糖苷酶染色，使用小鼠处理的对照组和替米罗治疗的对照组以及HGPS成纤维细胞检测衰老。细胞培养并用载体或替米罗莫司处理55天，然后用b-半乳糖苷酶（b-Gal）染色。数字表示b-Gal衰老细胞的频率。右面板对应于模拟治疗和替米罗明治疗的b-Gal阳性HGPS成纤维细胞的高倍图像。比例尺：50μM（n=3）。（D） 使用（A）中描述的相同细胞和培养条件来测量单丹酰尸胺（MDC）的自噬。数据表示为平均值±S.D.（*p值≤0.05；n=4）。（E） 通过测量糜蛋白酶样蛋白酶体活性，在（A）中使用的相同细胞中测定蛋白酶体活性。在指定的时间段内，每隔一天用1.0μM替米罗莫司模拟处理或处理细胞。计算相对于模拟处理细胞的活性百分比。数据表示为平均值±S.D.（*p值≤0.05；n=5）。（F） 对照组和HGPS成纤维细胞中A型层粘连蛋白的典型western印迹。在指定的时间段内，用1.0μM替米罗莫司模拟处理或隔天处理细胞。用抗层粘连蛋白A/C和抗β-肌动蛋白抗体（n=3）检测印迹。（G） 在小组（H）中，用抗层粘连蛋白A/C抗体进行免疫印迹分析，测定每个样本中A型层粘连的折叠表达。水平表示为相对于模拟处理的正常细胞（n=3）的折叠表达±S.D。
图4
图4。Temsirolimus不影响HGPS线粒体功能障碍。
（A） 对模拟处理或替米罗治疗的对照组（GMO3349C）和HGPS（HGADFN003）成纤维细胞（治疗9天）进行免疫组化。使用抗NADPH氧化酶亚基4（Nox4）和前体蛋白的抗体。显示了具有代表性的图像（n=4）。标尺：20μm。（B） 采用Western blot分析对照组（GMO3349C）和HGPS细胞（HGADFN003，HGADFN227）用1μM替米莫司处理9天。使用抗Nox4和β-肌动蛋白抗体。显示了一个具有代表性的图像（n=4）。（C） Nox4水平的量化标准化为β-肌动蛋白，并表示为相对于对照细胞的百分比（*p值≤0.05；n=4）。（D） 在第9天，对模拟治疗或替米西罗霉素治疗的对照组（GMO3349C）和HGPS（HGADFN003）成纤维细胞进行免疫化学。使用抗细胞色素c氧化酶亚基II（CoxII）和前体蛋白的抗体。显示了具有代表性的图像（n=4）。标尺：20μm。（E） 采用Western blot分析对照组（GMO3349C）和HGPS细胞（HGADFN003，HGADFN227），用1μM替米司莫司处理9天。使用抗CoxII和β-肌动蛋白抗体。如图所示为代表性图像（n=4）。（F） CoxII水平的定量标准化为β-肌动蛋白，并以相对于对照细胞的百分比表示（*p值≤0.05；n=4）。（G） 如方法所述，通过测量氧化二氯荧光素（DCF）水平来测定细胞内ROS水平。数据表示相对于模拟处理的对应物的平均百分比±S.D.（*p值≤0.05；n=5）。（H） 如方法中所述，使用CellTiter-Glo分析测定细胞ATP水平。数据表示相对于模拟处理的对应物的平均百分比±S.D.（*p值≤0.05；n=5）。
图5
图5。Temsirolimus不会影响HGPS细胞中活性氧和超氧化物的水平。
（A） 对对照组（GMO3349C）和HGPS（HGADFN003）成纤维细胞进行免疫化学检测，模拟处理或替米洛明处理指定时间。用ROS的氧化应激检测试剂和超氧化物检测试剂对活细胞进行染色。阴性对照用N-乙酰-L-半胱氨酸处理以消除信号强度。阳性对照用绿脓杆菌素处理以诱导活性氧的产生。DNA用Hoechst 33342染色。显示了具有代表性的图像（n=4）。标尺：20μm。（B） 使用与（A）中相同的细胞和检测试剂进行方法中所述的96 well微孔板分析。计算相对于模拟处理对照细胞的活性百分比。数据表示为平均值±S.D.（*p值≤0.05；n=4）。
图6
图6。Temsirolimus不会影响HGPS细胞中的DNA损伤水平。
（A） 对照组（GMO3349C）和HGPS（HGPSFN003）细胞的免疫组织化学，模拟处理或用1.0μM替米罗莫司处理9天。抗γH2A抗体。使用X和53BP1（n=4）。比例尺：20μm。（B） 对照组（GMO3349C）和HGPS（HGPSFN003）细胞的免疫组织化学，模拟处理或用1.0μM替米罗莫司处理9天。抗γH2A抗体。使用X和Rad51（n=4）。右侧增加了高倍照片，白色箭头表示γH2A的定位。X和Rad51。比例尺：20μm。（C） 采用Western blot分析对照组（GMO3349C）和HGPS细胞（HGADFN003，HGADFN227），用1μM替米司莫司处理9天。使用了针对53BP1和β-肌动蛋白的抗体。如图所示为代表性图像（n=4）。（D） 53BP1水平的量化归一化为β-actin，并表示为相对于对照细胞的百分比（*p值≤0.05；n=4）。（E） 使用1μM替西罗莫司处理9天的对照（GMO33349C）和HGPS细胞（HGADFN003，HGADFN127）的蛋白质印迹分析。使用了抗Rad51和β-肌动蛋白的抗体。如图所示为代表性图像（n=4）。（F） Rad51水平的量化标准化为β-肌动蛋白，并表示为相对于对照细胞的百分比（*p值≤0.05；n=4）。
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赠款和资金

这项工作得到了Progeria研究基金会以及德国研究基金会（598946）（KD）、DFG和慕尼黑技术大学（TUM）在开放获取出版计划框架内的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。