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.2017年1月31日;8(5):8162-8172.
doi:10.18632/目标14131。

肿瘤抑制microRNA-218通过靶向前列腺癌中的mTOR成分RICTOR抑制肿瘤血管生成

附属公司

肿瘤抑制microRNA-218通过靶向前列腺癌中的mTOR成分RICTOR抑制肿瘤血管生成

冰冠等。 Oncotarget公司. .

勘误表in

摘要

微RNA是一种小的非编码RNA,可以通过靶向mRNA进行翻译抑制或降解来调节基因表达。许多证据表明,miR-218在包括前列腺癌在内的许多人类癌症中是一种肿瘤抑制因子。然而,miR-218在肿瘤血管生成中的潜在作用以及在前列腺癌和其他癌症中的机制尚不清楚。在本研究中,我们证明miR-218在体内外抑制PCa细胞的肿瘤血管生成。mTOR组分2 RICTOR是miR-218的直接靶点,miR218-RICTOR-VEGFA轴是抑制PCa细胞肿瘤血管生成的机制。RICTOR敲除现象复制miR-218过表达抑制前列腺癌血管生成。总之,我们的研究结果表明,miR-218的下调通过前列腺癌RICTOR/VEGFA轴促进肿瘤血管生成,为前列腺癌发生的潜在机制提供了新的见解,并揭示了miR-219作为有用的血清生物标记物和人类前列腺癌新的治疗靶点的潜力。

关键词:RICTOR公司;VEGFA;血管生成;microRNA-218;前列腺癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。miR-218在PCa细胞中下调并抑制体外HUVEC迁移
A类用miRNA实时PCR分析正常前列腺上皮细胞系BPH-1和不同PCa细胞系(即LNCaP、C4-2和CWR22Rv1)中miR-218的表达水平。U6用于归一化。B类构建了稳定的miR-218过表达PCa细胞系。C类miR-218的过度表达降低了条件培养基(CM)对HUVEC的招募,条件培养基是从LNCaP、C4-2和CWR22Rv1/LV3-NC或LV3-miR-217细胞中收集的。在18小时内,HUVEC被播种在Transwell插件的上侧。每孔计数6个随机场(200×)中的迁移细胞。D类miR-218的过度表达抑制了共培养系统中HUVEC的招募。在24孔板底部培养的癌细胞用于招募接种在跨孔插入物上侧的HUVEC。这些数据代表了三个独立的实验。星号表示与对照组相比,在*p<0.05,**p<0.01时存在显著差异。
图2
图2。miR-218抑制体外HUVEC增殖和导管形成
A类miR-218的过度表达降低了HUVECs的增殖。在MTT试验之前,用无血清培养基(SFM)或稀释的CMs处理HUVEC 48小时。B类miR-218过表达抑制了HUVEC的管形成。将稀释在SFM或CM中的HUVEC添加到Matrigel-coated微孔中,并培养4小时。拍摄了管状结构的代表性照片,并计算了整个现场的管道数量(右)。这些数据代表了三个独立的实验*与NC组相比有显著性差异(p<0.05、**p<0.01)。
图3
图3。miR-218抑制VEGFA表达
A类用实时PCR分析转染LV3-NC或LV3-miR-218的LNCaP、C4-2和CWR22Rv1细胞中VEGFA的表达水平。B类用Western blotting分析VEGFA蛋白水平。C类用ELISA法测定CMs中分泌的VEGFA蛋白的浓度。这些数据代表了三个独立的实验*与NC组相比,p<0.05,**p<0.01。
图4
图4。miR-218通过靶向RICTOR 3'-UTR抑制VEGFA表达
A类显示了包含野生型或突变结合位点的RICTOR 3'-UTR区域以及miR-218和RICTOR 3’-UTR(WT和MUT)之间的序列互补性。B类用野生型或突变型3'-UTR报告质粒转染LV3-NC或LV3-miR-218 293T细胞后,分析相对荧光素酶活性。miR-218的过度表达抑制了野生型报告者的荧光素酶活性(50%)。C类用实时PCR分析转染LV3-NC或LV3-miR-218的LNCaP、C4-2和CWR22Rv1细胞中RICTOR的表达水平。D类RICTOR蛋白水平通过Western blotting分析进行分析。E.用Western blotting分析AKT在Ser-473、p-mTOR、HIF1α和HIF2α的磷酸化状态的蛋白质水平。GAPDH被用作内部控制。结果代表了三个独立的实验。数值显示为平均值±标准偏差。*p<0.05,**p<0.01。
图5
图5。miR-218抑制肿瘤生长和血管生成体内
A类接种2周后,取CWR22Rv1/LV3-NC和CWR22Rv1/LV3-miR-218亚克隆的皮下异种移植物。B类两组之间的肿瘤重量。数值显示为平均值±标准偏差。*p<0.05,**p<0.01。C类-F类通过免疫组织化学方法分析了CWR22Rv1/LV3-NC和CWR22Rv1/LV3-miR-218异种移植物石蜡固定肿瘤切片中CD31、PCNA、RICTOR和VEGFA的表达;代表性照片以放大倍数×200(CD31)或×400(PCNA、RICTOR、VEGFA)显示。G公司CWR22Rv1/LV3-NC细胞可诱导兔角膜新生血管形成(n=3)。新生血管侵入角膜,连接肿瘤(黄色箭头)和角膜缘血管丛。
图6
图6。RICTOR基因敲除减少前列腺癌细胞的血管生成
A类-B类采用实时PCR和Western blotting分析证实了转染LV3-shRICTOR#1/#2的LNCaP和C4-2细胞中RICTOR在mRNA和蛋白质水平上的敲除。C类RICTOR敲低降低了HUVECs的募集。从C4-2/LV3-shNC和C4-2/LF3-shRICTOR#1细胞或培养在24孔板底部的癌细胞中收集的条件培养基(CM)用于招募HUVEC。每孔计数6个随机场(200×)中的迁移细胞。D类RICTOR敲除减少了SFM或CM中稀释的HUVEC的管形成。拍摄了管状结构的代表性照片,并统计了整个现场的管道数量。E类用ELISA法测定CMs中分泌的VEGFA蛋白的浓度。F类用Western blotting分析p-mTOR、HIF1α、HIF2α和VEGFA的蛋白水平。GAPDH被用作内部控制。这些数据代表了三个独立的实验。数值显示为平均值±标准偏差。*p<0.05,**p<0.01。
图7
图7。miR-218-RICTOR/pAKT/pmTOR-HIF1α和HIF2α-VEGFA信号在PCa细胞血管生成特性中作用的示意图

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