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.2017年4月6日;20(4):490-504.e5。
doi:10.1016/j.stem.2016.08.019。 Epub 2016年12月22日。

患者特异性iPSC-Derived内皮细胞在BMPR2突变携带者中发现保护肺动脉高压的途径

附属公司

患者特异性iPSC-Derived内皮细胞在BMPR2突变携带者中发现保护肺动脉高压的途径

顾明霞等。 细胞干细胞. .

摘要

在家族性肺动脉高压(FPAH)中,常染色体显性疾病引起的BMPR2突变只有20%的渗透性,表明遗传变异提供了缓解疾病的修饰物。在这里,我们比较了来自三个未受影响突变携带者(UMC)、FPAH患者和性别匹配的对照组家族的诱导多能干细胞衍生内皮细胞(iPSC-EC),以研究这种变异。我们的分析确定了UMC-iPSC EC的特征,这些特征与BMPR2信号的修饰物或差异表达基因有关。与UMC-iPSC-EC和对照细胞相比,FPAH-iPSC-EC的粘附、存活、迁移和血管生成减少。UMC细胞的“挽救”表型与特定BMPR2激活剂的增加和/或抑制剂的减少有关,细胞粘附性的改善可能归因于相关信号的保存。生存率的提高与BIRC3的增加有关,并且与BMPR2无关。因此,我们的研究结果强调了FPAH的保护性改性剂,这可能有助于制定未来的治疗策略。

关键词:骨形态发生蛋白受体2;细胞粘附;细胞信号;细胞存活;内皮功能障碍;诱导多能干细胞衍生内皮细胞;外显率;肺动脉高压;转录组分析;未受影响的突变携带者。

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作者没有相互冲突的经济利益。

数字

图1
图1。FPAH iPSC-EC表现出相似的形态和骨形态发生蛋白2与UMC相比,表达但粘附和存活受损
(A) 从皮肤成纤维细胞衍生的多能干细胞分化而来的内皮细胞(EC)呈现典型的鹅卵石状形态,含有3,3′-二十八烷基内碳蓝蛋白标记的低密度脂蛋白(Dil-LDL,红色),并且EC表面标记物VE-Cadherin(绿色)呈阳性。蓝色:DAPI。比例尺=100μm(顶部)、50μm(中部)和10μm(底部)。(B)骨形态发生蛋白2通过实时PCR和(C)western免疫印迹以及BMPR2蛋白密度定量法对来自三个家庭的对照组、UMC和FPAH患者的iPSC-EC中的基因表达进行量化。(D–E)特定于等位基因骨形态发生蛋白2用液滴数字PCR检测表达。野生型等位基因探针用FAM(蓝点)标记,突变等位基因的探针用HEX(绿点)标记。数据显示家族1和3的错义突变和家族2的缺失突变。(F) 将iPSC-EC(10000个/孔)接种到24孔板上,或者未涂覆(塑料),或者涂覆有指定的基质,并允许粘附1小时。去除悬浮液中的非粘附细胞,用PBS冲洗粘附细胞,然后用Hoechst染色并成像。通过计算每孔(10倍放大)六个随机场中的总数,计算平均核数。(G) iPSC-EC暴露于隔夜取血清(0%FBS)或复氧[复氧,缺氧48小时,(0.5%O2),然后在室温空气中48小时]。通过Caspase-Glo®3/7测定法测定细胞凋亡。横线表示n=3个家族的平均值±标准偏差,每个家族有3个生物重复*与对照组相比p<0.05,#p<0.05与UMC,Bonferroni后测的单向方差分析。另请参见图S1和图S2。
图2
图2。UMC iPSC-ECs显示pP38信号保持和ITGB1增加,导致细胞粘附性改善
(A–C)BMP4(10ng/ml)刺激1小时后,上述具有代表性的西方免疫标记物和三个家族iPSC-EC中pP38的密度分析。或PBS作为车辆。(D) 上述具有代表性的西方免疫印迹和pP38活化的密度分析,在iPSC-EC粘附到塑料表面15和60分钟后进行(n=3个家族,每个家族3个生物复制)。(E) 来自UMC(家族1)的iPSC EC用pP38抑制剂SB239063预处理30分钟,并如图1F所示测量细胞与指定底物的粘附力一小时。条形图表示n=3个实验的平均值±SD。用MKK6构建物转染FPAH患者的(F–G)iPSC-EC(oeMKK6系列)持续四天。oeCtrl:iPSC-EC转染空结构。(F) 典型的western免疫印迹和密度测定显示细胞粘附试验(G)后的pP38和β1-整合素(ITGB1)水平,如图1F所示。典型的免疫印迹和密度测定显示,在基线(H)或细胞粘附条件(I)下,整合素β1(ITGB1)。上带是β1-整合素的成熟形式,下带是前体(Salicioni等人,2004)。(J) 用对照siRNA(siCtrl)或ITGB1标准siRNA(siITGB1标准). 四天后评估细胞粘附。(K) 用ITGB1阻断抗体(抗人CD29,克隆Mab13,20μg/ml)在37°C下预处理UMC iPSC-EC 60分钟,并如前所述测量细胞与底物的粘附1小时。(左)ITGB1标准在FPAH iPSC-EC中过度表达,四天后评估细胞粘附。条形图表示n=3个实验的平均值±SD。(A–D,I)*p<0.05 vs.载具,#p<0.05 vs.UMC中相同条件,Bonferroni后测的双向方差分析。(E,G,J-L)*p<0.05,**p<0.01 vs.车辆,oeCtrl或siCtrl,t试验.(F)*p<0.05 vs.oeCtrl,未配对t试验.(H)#p<0.01 vs.UMC,使用Bonferroni后验进行单因素方差分析。另请参见图S3。
图3
图3。BMPR2激活剂的高表达和抑制剂的低表达骨形态发生蛋白2通用汽车公司
(A–C)顶部有代表性的西方免疫印迹和下面的密度分析显示了三个不同家族的对照组、UMC和FPAH患者iPSC-EC中的BMP调节因子。条形代表n=3个生物复制品的平均值±SD*通过单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验,与对照组相比p<0.05,与UMC相比#p<0.05。(D) 图中显示了UMC iPSC-EC中与pSMAD1/5-ID1信号和pP38信号相关的BMP调节器的平衡。另请参见图S4。
图4
图4。UMC中补偿性pP38信号转导和细胞粘附与BMP调节因子相关
(A–C)用对照siRNA(siCtrl)或轻轨P1siRNA(si轻轨P1)四天后进行了测量。细胞粘附到塑料上15分钟后,在顶部和下面分别对(A)pP38(B)ITGB1进行代表性免疫印迹和密度测定;(C) 如图1所示测量细胞粘附力。(D–F)轻轨P1在FPAH iPSC-EC中过度表达。4天后,在与塑料粘附15分钟后,我们评估了(D)pP38(E)ITGB1;(F) 细胞粘附。oeCtrl:iPSC-EC转染空结构。油当量(oe)轻轨P1:转染过表达构建物的iPSC-EC轻轨P1(G-H)共转染轻轨P1ITGB1标准轻轨P1、ITGB1和MKK6型在FPAH iPSC-EC中进行,四天后进行测量。(G) LRP1、ITGB1和Flag-MKK6的代表性免疫印迹和密度测定;(H) 如图1所示测量细胞粘附力。(I,J)家族3的FPAH iPSC-EC用对照或GREM1 siRNA进行治疗,四天后进行测量。(一) 细胞与塑料粘附15min后,ITGB1和pP38的代表性免疫印迹(左)和密度测定(右);(J) 如图1所示测量细胞粘附力。条形图表示n=3个实验的平均值±SD。(A–B,D–E,I)*p<0.05 vs.Vehicle,#p<0.05 vs.siCtrl或oeCtrl粘附力15′,双向方差分析与Bonferroni后测。(H) *p<0.05**p<0.01 vs.对照组,#p<0.05 vs.oeCtrl,Bonferroni后测的单向方差分析。(C、F、J)*p<0.05 vs.siCtrl或oeCtrl,t检验参见图S5。
图5
图5。RNA-Seq基因表达分析
(A) 热图显示对照组和UMC与患者之间的71度(n=11,p<0.01,折叠变化>2.0)。其中41个基因上调,30个基因下调。(B) 定量实时PCR比尔C3FPAH患者的基因表达。(C)BIRC3公司siRNA降低基因表达。(D)经siRNA处理的UMC iPSC-EC的Caspase活性BIRC3公司对血清停药(0%FBS)和缺氧后复氧(Reoxy)的反应。(E) 建议的模型:统一市场委员会的补偿机制。增加BMPR2激活物LRP1和/或Caveolin1,减少BMPR2阻遏物,阻断BMP配体的Gremlin1和/或阻断BMPR2 1型共受体(BMPR1)的FKBP12(FKBP1A),增强下游pP38信号通路,改善β1-整合素循环。再加上β1-整合素总量的增加,这些特征导致代偿性细胞粘附到各种细胞外基质。此外,增加了比尔C3基因表达导致保存细胞存活,以应对缺氧后的血清退出和复氧。这些特征保护UMC免受与PAH发展相关的EC功能障碍。(F) 利用FPAH患者iPSC-EC中71个失调基因,利用Reactome通路数据库(FDR<0.1)进行功能富集分析。(G–H)基因概念网络,显示与(F)中确定的顶级信号通路相关的基因名称。(I,J)RNA-Seq的转录因子(TF)基序富集分析:在RNA-Seq3个差异表达基因的3kb±转录起始位点内检测TF的假定占据位点分布。分析表明,在FPAH iPSC-EC中,75%和55%的下调基因中,SMAD2和MAFF基序表现出独特的过表达,而在FPAH-iPSC-EC中,44.1%的上调基因中,SOX8和SPZ1基序表现为过表达。条形图表示n=3个实验的平均值±SD。(B) *p<0.05,与UMC相比,Bonferroni后测的单向方差分析。(C,D)*p<0.05 vs.siCtrl,未配对t试验参见图S6和图S7。
图6
图6。家族1 FPAH患者iPSC-EC基因编辑后EC粘附、存活、pP38信号转导和基因表达水平正常化
使用CRISPR/Cas9介导的同源性定向修复纠正FPAH患者iPSCs中的BMPR2突变。(A) 杂合点突变354T>G在图中显示为双峰。(B) 校正354T>G突变后,只检测到一个单峰。(C) 基因编辑后家族1中iPSC-EC的粘附。(D) 通过Caspase-Glo®3/7分析评估iPSC-EC的凋亡。(E) BMP4治疗后1h(10ng/ml)通过免疫印迹和密度测定激活pP38信号。(F–N)的表达式骨形态发生蛋白2在iPSC-EC中检测相关基因和RNA-Seq鉴定的异常表达基因。条形图表示n=3个实验的平均值±SD*p<0.05,**p<0.01与对照组或载体,#p<0.05vs.UMC,δp<0.05-FPAH,Bonferroni多重比较试验的单向方差分析(C-D,F-N),以及Bonferrroni后验的双向方差分析(E)。
图7
图7。1家族FPAH患者iPSC-EC基因编辑后BMP4刺激使血管生成和细胞迁移正常化
(A) 基因编辑(FPAH-CRISPR)后来自对照、UMC、FPAH和FPAH的iPSC EC的管形成的代表性图像,通过定量分析,表明将细胞接种在生长因子减少的基质凝胶上6小时后形成的管的数量。(B) 与伤口闭合相关的代表性图像和定量数据。将涂布剂涂布于100%融合的iPSC-EC上,并在0和12小时时成像细胞向伤口的迁移。在接种iPSC-ECs时涂布(C,D)BMP4(10ng/ml)。按照(A和B)所述进行血管生成分析(C)和迁移分析(D)。(E) 疾病发展的拟议模型:(i)控制具有正常的BMPR2和保护性修饰物,因此没有FPAH或EC脆弱性;(ii)UMC已骨形态发生蛋白2突变时,保护性修饰物可以保护发育中的FPAH,但在BMP配体水平较低时仍可能表现出脆弱性;(iii)FPAH患者骨形态发生蛋白2突变且缺乏保护性修饰物,导致与FPAH相关的EC功能障碍;(iv)纠正后骨形态发生蛋白2突变,与FPAH发展相关的EC功能障碍被逆转。然而,当BMP配体水平较低时,缺乏保护性修饰物仍会导致EC脆弱性。条形图表示n=3个实验的平均值±SD*与对照组相比,p<0.05,**p<0.01#与UMC相比p<0.05,与FPAH相比δp<0.05,与Bonferroni多重比较测试的单向方差分析。

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