Low-molecular-weight hyaluronan (LMW-HA) accelerates lymph node metastasis of melanoma cells by inducing disruption of lymphatic intercellular adhesion

doi:10.1080/2162402X.2016.1232235

.2016年9月9日；5（11）：e1232235。

doi:10.1080/2162402X.2016.1232235。 2016年eCollection。

低分子量透明质酸（LMW-HA）通过诱导淋巴细胞间粘附的破坏加速黑色素瘤细胞的淋巴结转移

燕都¹, 曹曼琳², 刘一文³, 何一清³, 杨翠霞³, 满武（Man Wu）³, 张国良³, 冯高¹

附属公司

¹上海交通大学附属第六人民医院分子生物学教研室；中国上海交通大学医学院上海第六人民医院临床实验室。
²中国上海交通大学医学院上海第六人民医院康复医学系。
³上海交通大学附属第六人民医院分子生物学系，中国上海。

PMID： 27999746
预防性维修识别码：项目编号5139649
内政部： 2016年10月10日至2016年12月22日

低分子量透明质酸（LMW-HA）通过诱导淋巴细胞间粘附的破坏加速黑色素瘤细胞的淋巴结转移

燕都等。肿瘤免疫学. 2016.

.2016年9月9日；5（11）：e1232235。

doi:10.1080/2162402X.2016.1232235。 2016年eCollection。

作者

燕都¹, 曹曼林², 刘一文³, 何一清³, 杨翠霞³, 满武（Man Wu）³, 张国良³, 冯高¹

附属公司

¹上海交通大学附属第六人民医院分子生物学教研室；中国上海交通大学医学院上海第六人民医院临床实验室。
²中国上海交通大学医学院上海第六人民医院康复医学系。
³上海交通大学附属第六人民医院分子生物学系，中国上海。

PMID： 27999746
预防性维修识别码：项目编号5139649
内政部： 10.1080/2162402X.2016.1232235

摘要

内皮完整性缺陷引发肿瘤细胞的淋巴转移。据报道，来源于血浆和间质液的低分子透明质酸（LMW-HA）与肿瘤淋巴转移有关。此外，LMW-HA被证明可以破坏淋巴管内皮的完整性，从而促进肿瘤细胞的淋巴转移。到目前为止，关于LMW-HA如何调节淋巴管内皮细胞粘附连接并影响癌细胞转移到淋巴管的报道很少。本研究旨在揭示LMW-HA介导肿瘤淋巴转移的新机制。在这里，我们采用黑色素瘤转移模型来研究LMW-HA是否通过破坏淋巴管内皮完整性促进肿瘤细胞从病灶转移到远处淋巴结。我们的数据表明，LMW-HA显著诱导黑色素瘤细胞向淋巴结转移，并加速间质淋巴流体内进一步的实验表明，黑色素瘤细胞在人皮肤淋巴管内皮细胞（HDLEC）单层中的迁移增加伴随着淋巴管内皮屏障功能受损和通透性增加。机制研究表明，VE-cadherin-β-catenin途径和相关信号参与调节内皮细胞之间的相互作用，当存在LMW-HA受体（LYVE-1）抗体时，可以显著抑制淋巴管内皮细胞的破坏。因此，我们的研究结果表明，LMW-HA对淋巴管内皮连续性具有破坏作用，从而促进黑色素瘤淋巴转移，并提示与VE-cadherin介导的淋巴细胞间连接相关的细胞信号机制。

关键词：HDLEC；LMW-HA；淋巴细胞间粘附；淋巴转移；黑色素瘤。

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数字

**图1。**
LMW-HA增强B16F10细胞向淋巴结转移体内（A）首次接种后第7天通过qRT-PCR定量淋巴结中黑色素瘤标记物TRP-1的mRNA水平。计算LMW-HA-、HMW-HA-和中等剂量处理小鼠淋巴结中TRP-1 mRNA的水平。ΔC_T型=C类_T型（TRP）−C_T型（GAPDH）。Bars代表平均值±SD。进行了三项涉及LMW-HA-、HMW-HA-和中等剂量处理小鼠的实验，每组五只小鼠，n=3*第页< 0.05, **第页<0.01，方差分析。（B）左侧面板显示了接种B16F10+LMW-HA、B16F10+HMW-HA和B16F10-培养基后17天小鼠右侧腘窝淋巴结的代表性照片。黑色转移灶可见，因为B16F10细胞产生黑色素。右侧面板显示了小鼠的对侧淋巴结。（单位：mm）（C）使用抗LYVE-1抗体对LMW-HA-、HMW-HA-和中等剂量治疗组足垫部分代表性淋巴管进行常规免疫组织化学分析。黄色箭头强调LYVE-1阳性淋巴管。红色箭头表示淋巴管扩大中的黑色素瘤细胞。（比例尺：50µm）。（D）比较LMW-HA-、HMW-HA-和中等剂量处理小鼠的淋巴管大小，n=5**第页<0.01，方差分析。（E） LMW-HA降低淋巴细胞间粘附体内脚垫部分的共焦成像，免疫染色的足蛋白（红色）和VE-卡德林（绿色）。结果显示在三个实验结果的代表性图像中，每个实验条件下有五只动物（用白色箭头表示）。（比例尺：25µm）。（F）测量这些小鼠的肿瘤重量，n=5，方差分析。

**图2。**
LMW-HA增强C57BL/6小鼠的间质淋巴流。（A）将20µL高分子量FITC-右旋糖酐（8 mg/mL）与LMW-HA（5µg）、HMW-HA（6µg。每个实验组使用五只小鼠。在LED照明下每隔30分钟拍摄一次照片，直到120分钟过去。显示了五只小鼠的代表性样本。测定注射部位附近的FITC-右旋糖酐荧光。（B）初始时间（0分钟）的荧光强度设置为100%，其他时间点的荧光值计算为0分钟值的百分比。条形代表平均值±SD，n=5*第页<0.05，无统计学意义。

**图3。**
LMW-HA破坏淋巴管内皮细胞屏障功能，增加黑色素瘤细胞在淋巴管内皮的迁移。（A）通过HDLECs（n=3）的经内皮电阻（TEER）测定LMW-HA（10µg/mL）、HMW-HA（10ug/mL）、VEGF-A（100 ng/mL）和培养基对淋巴内皮屏障功能的影响。箭头指示添加时间。（B，C）计算通过淋巴管内皮细胞单层迁移的B16F10（B）和A375（C）细胞数量的累积数据，n=3*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，方差分析。

**图4。**
LMW-HA对淋巴细胞间粘附影响的机制研究。（A）通过免疫荧光和指骨样蛋白染色评价LMW-HA对HDLEC中VE-cadherin、β-catenin和F-actin定位的影响。用LMW-HA（10µg/mL）或VEGF-A（100 ng/mL）处理2 h后，VE-cadherin（红色）和β-catenin（绿色）变得杂乱无章，观察到许多穿过细胞体的应力纤维（绿色）（如白色箭头所示）。在共焦显微镜下观察细胞。显示了三个实验的一个代表性图像。（比例尺：25µm）。（B，C）测定HDLEC中VE-cadherin、β-catenin和Src磷酸化水平。用10µg/mL LMW-HA、10µg/mL HMW-HA、100 ng/mL VEGF-A或培养基刺激HDLEC 30分钟。用所示抗体对刺激细胞裂解物进行免疫印迹分析。GAPDH是装载控制。

**图5。**
抗淋巴管内皮透明质酸受体-1抗体抑制LMW-HA对HDLECs的作用。所有HDLEC预先用10µg/mL LYVE-1中和抗体或同型IgG孵育。（A）进行TEER测定以测量淋巴管内皮屏障功能。（B，C）检测LMW-HA对黑色素瘤细胞通过淋巴管内皮细胞单层迁移的影响，n=3*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，无统计学意义。（D）通过免疫细胞荧光分析评估VE-cadherin、β-catenin和F-actin的分布，VE-cadherin、β-catanin和F-actin的形态恢复到其原始状态（如白色箭头所示）。（E） western blotting检测VE-cadherin磷酸化和β-catenin磷酸化，n=3*第页<0.05，方差分析。（F） western blotting检测到Src磷酸化，n=3*第页<0.05，方差分析。

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