Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease (APE1) Is Acetylated at DNA Damage Sites in Chromatin, and Acetylation Modulates Its DNA Repair Activity

doi:10.1128/MCB.00401-16

.2017年3月1日；37（6）：e00401-16。

doi:10.1128/MCB.00401-16。 2017年3月15日印刷。

人无尿/无嘧啶核酸内切酶（APE1）在染色质中的DNA损伤位点被乙酰化，乙酰化调节其DNA修复活性

附属公司

¹美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心遗传学、细胞生物学和解剖学系。
²美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿卫理公会研究所放射肿瘤学系。
^三尼康仪器公司，美国田纳西州孟菲斯。
⁴旁遮普中央大学，印度巴欣达。
⁵美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心血液/肿瘤科儿科。
⁶美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症研究所。
⁷美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德和帕梅拉自助癌症中心。
⁸美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心遗传学、细胞生物学和解剖学系kishor.bhakat@unmc.edu。

PMID： 27994014
预防性维修识别码： PMC5335514
内政部： 10.1128/MCB.00401-16

人无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶（APE1）在染色质中DNA损伤部位乙酰化，乙酰化调节其DNA修复活性

Shrabasti Roychoudhury公司等。分子细胞生物学. 2017.

.2017年3月1日；37（6）：e04041-16。

doi:10.1128/MCB.00401-16。 2017年3月15日印刷。

附属公司

¹美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心遗传学、细胞生物学和解剖学系。
²美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿卫理公会研究所放射肿瘤学系。
^三尼康仪器公司，美国田纳西州孟菲斯。
⁴印度巴辛达旁遮普中央大学。
⁵美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心血液/肿瘤科儿科。
⁶美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症研究所。
⁷美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德和帕梅拉自助癌症中心。
⁸美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心遗传学、细胞生物学和解剖学系kishor.bhakat@unmc.edu。

PMID： 27994014
预防性维修识别码： PMC5335514
内政部： 10.1128/MCB.00401-16

摘要

无嘌呤/无嘧啶（AP）位点是基因组中最常见的DNA损伤，抑制转录并阻止复制。哺乳动物细胞中修复AP位点的主要酶是AP核酸内切酶（APE1），它通过碱基切除修复（BER）途径发挥作用。虽然APE1修复AP站点的机制在体外APE1是如何修复细胞内AP位点的，目前尚不清楚。这里，我们表明APE1在与染色质中的AP位点结合后被乙酰化（AcAPE1），AcAPE1在整个细胞周期中只存在于染色质上。APE1 N-末端结构域中乙酰化赖氨酸残基的正电荷对染色质结合至关重要。乙酰化介导的APE1 N-末端结构域赖氨酸残基的正电荷中和引起构象变化；这反过来又增强了APE1的AP内切酶活性。在没有APE1乙酰化的情况下，细胞在基因组中积累AP位点，并对DNA损伤剂表现出更高的敏感性。因此，哺乳动物细胞与酿酒酵母或大肠杆菌细胞需要APE1乙酰化，以便有效修复基因组中的AP位点和碱基损伤。我们的研究表明，APE1乙酰化是维持基因组完整性的BER途径的一个组成部分。

关键词：AP站点；APE1；DNA损伤；乙酰化；基底切除修复；内源性DNA损伤。

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图1
AcAPE1仅与染色质相关，并与浓缩染色体结合。（A和B）用抗APE1和抗AcAPE1抗体对异步正常肺成纤维细胞IMR90细胞和肺腺癌A549细胞进行免疫染色，用DAPI进行复染，并用共焦显微镜和3D SIM进行可视化。（C） AcAPE1与组蛋白H3或活性增强子特异性组蛋白标记乙酰化的H3K27（H3K27Ac）的克隆化。（D） BJ-hTERT细胞经血清饥饿72h后固定于不同时间点。用抗APE1和抗AcAPE1抗体对细胞进行免疫染色，并用抗TO-PRO-3碘化物抗体进行复染。（F） BJ-hTERT细胞要么被血清饥饿72小时（G₀/G公司₁阶段），用诺可唑（有丝分裂细胞）或蚜虫灵（G₁/使用150 mM或300 mM含盐溶解缓冲液分离全细胞提取物。Western blot分析抗APE1和抗AcAPE1水平。使用抗-HSC70作为负载对照。（G）用小鼠抗APE1和兔抗APE1（mAPE1&rabbit-APE1）、小鼠抗小鼠APE1、兔抗AcAPE1（mAPE1&rAcAPE1）、兔抗AcAPE1及鼠抗组蛋白H3（mHistone H3&rAcAP E1）进行近端结扎分析，以确认AcAPE的染色质关联。以小鼠IgG（mIgG）和兔抗AcAPE1抗体作为对照。PLA病灶中至少有50个细胞被计数。（H）染色质上p300和AcAPE1的染色（DAPI）。（一）用E1A和突变E1A转染HCT116细胞，转染后48小时进行IF。细胞用抗p300和抗APE1或抗AcAPE1免疫染色，用DAPI复染。

图2
乙酰化Lys残基的正电荷而非乙酰化对APE1的染色质结合至关重要。（A）表达具有Lys位点特异性APE1突变的不同突变体的细胞用抗FLAG抗体（标记为FLAG的行）进行免疫染色，并用DAPI（标记为Merge的行）反染。（B）通过免疫染色分析乙酰化位点突变体的亚细胞定位；表达不同Lys位点特异性APE1突变突变体的细胞用抗FLAG抗体或抗层粘连B抗体染色，并用DAPI进行复染。（C）用抗FLAG体外表达这些蛋白的细胞中FLAG标记WT和突变APE1水平的可溶性核和染色质提取物的Western blot分析。使用抗-APE1、抗组蛋白H3和抗小鼠Sin3a（mSin3a）作为对照。（D和E）实验示意图概述。使用APE1特异性siRNA（APE1Si RNA）下调HEK293T细胞中的APE1，48小时后，用含有WT APE1或K27Q或H309N突变APE1的表达质粒转染细胞。使用抗FLAG和抗AcAPE1抗体进行IF检查共定位。共定位时，至少有50个FLAG阳性细胞被计数。用箭头指示的单元格在“合并”列中进一步放大。（E）（左）PLA使用抗FLAG和抗AcAPE1检测细胞中WT APE1和K27Q及H309N突变APE1的乙酰化。（右）对至少50个细胞进行计数，并绘制每个APE1突变的PLA信号百分比。

图3
APE1与染色质中的AP位点结合后被乙酰化。（A） BJ-hTERT细胞用MX（50 mM）处理指定时间。使用抗APE1和抗AcAPE1进行IF，并使用DAPI复染。（B）用不同剂量的MX处理HCT116细胞30 min，用抗APE1和抗AcAPE1进行IF，用DAPI进行复染。（C）用50 mM MX处理HCT116细胞30 min，用抗OGG1抗体进行IF，用DAPI进行复染。（D）用50 mM MX预处理或未预处理的BJ-hTERT细胞暴露于MMS（2 mM）1 h，用抗APE1和抗AcAPE1进行IF，用DAPI进行复染。共焦显微镜用于观察对照细胞和用MMS或MX或两者处理的细胞中AcAPE1的水平。（E）在GO诱导DNA损伤后，用抗OGG1抗体进行ChIP和Western blotting（ChIP-on-Western）检测染色质上AcAPE1和连接酶III的相关性。（F）在对照或MMS或MX处理的细胞中，AcAPE1与内源性p21启动子的关联通过启动子导向的ChIP使用抗AcAPE1。

图4
APE1乙酰化增强其AP内切酶活性。（A）在乙酰辅酶A存在或不存在的情况下，将重组（Rec.）APE1与p300 HAT结构域一起孵育，并用抗APE1和抗AcAPE1 Abs进行蛋白质印迹分析，以证实APE1的乙酰化。（B） APE1和*在体外*-乙酰化APE1。nt，核苷酸；P、劈开的产品。（C和D）动力学参数的值*K（K）_米*和k个_猫通过将33 pM酶在37°C下与不同浓度（0至160 nM）的底物孵育3分钟来计算。将酶动力学数据拟合到非线性最小二乘回归中，以获得*V（V）*_最大值和*K（K）_米*使用Michaelis-Menten方程和SigmaPlot软件得出的值。（E） APE1和AcAPE1的动力学参数比较。

图5
APE1乙酰化增强了其对染色质的稳定性及其与下游BER蛋白的相互作用。（A）连接酶III和AcAPE1在A549细胞中的克隆化。用抗连接酶III和抗AcAPE1抗体对细胞进行免疫染色。（B）用TSA-烟酰胺（NAM）处理或不处理WT或K5R突变型APE1过度表达的HEK293T细胞6h，用抗FLAG抗体免疫沉淀核提取物，并用抗XRCC1和抗FLAG Abs免疫印迹。（C） A549细胞在用Triton X-100（0.5%）（中间）或Triton X-100+盐（100 mM KCl）（底部）处理前后用多聚甲醛固定，并用抗APE1或抗AcAPE1抗体进行免疫染色，用DAPI进行复染。（D） APE1的乙酰化诱导APE1构象变化。显示了APE1和AcAPE1在280nm处的不同本征荧光发射光谱。A.U.，吸光度单位。

图6
APE1乙酰化对细胞生存和/或细胞增殖至关重要，APE1缺乏乙酰化会使细胞对DNA损伤剂敏感。（A和B）内源性APE1在HEK293T中下调^APE1siRNA使用Dox治疗的细胞。（A） FLAG标记的WT APE1、乙酰化缺陷突变体（Lys6、Lys7、Lys27、Lys31和Lys32突变为非乙酰化精氨酸[K5R]或谷氨酰胺[K5Q]的突变体）或NΔ33突变体在这些细胞中进一步过度表达。用葡萄糖氧化酶（100ng/ml，持续30分钟）处理或不处理细胞，并使用ARP试剂盒测量AP位点的数量。（B）代表AP站点数量的条形图/10⁵bp在不同APE1突变体存在下与载体控制相比。误差条表示平均值±标准偏差(n个= 3). （C） HEK293吨^APE1siRNA用DOX处理或不处理细胞，WT APE1、K5R和K5Q突变型APE1在体外表达。用葡萄糖氧化酶（100 ng/ml，持续30分钟）处理细胞或不处理细胞，并进行集落形成分析。条形图显示了存在不同APE1突变体时形成的菌落数量，与矢量控制相比。误差条表示平均值±标准偏差(n个= 3). （D和E）HCT116细胞组成性表达APE1 shRNA（HCT116^APE1shRNA用FLAG标记的WT APE1或乙酰化缺陷的APE1突变体（Lys6、Lys7、Lys27、Lys31和Lys32突变为非乙酰化精氨酸[K5R]或谷氨酰胺[K5Q]的突变体）转染细胞）。（D）使用抗APE1抗体进行蛋白质印迹分析以检测APE1水平。使用抗-HSC70作为负荷对照。（E） HCT116中测量了损伤敏感性^APE1shRNA体外表达不同APE1突变体的细胞。用增加剂量的MMS处理细胞1小时，并进行集落形成分析。

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