Asymmetric Arginine Dimethylation Modulates Mitochondrial Energy Metabolism and Homeostasis in Caenorhabditis elegans

doi:10.1128/MCB.00504-16

.2017年3月1日；37（6）：e00504-16。

doi:10.1128/MCB.00504-16。 2017年3月15日印刷。

不对称精氨酸二甲基化调节秀丽隐杆线虫线粒体能量代谢和平衡

梁莎¹, Hiroaki Daitoku公司², Sho Araoi公司^三, 尤塔·卡内科^三, 尤塔·高桥², Koichiro Kako先生^三, 福田昭史⁴

附属公司

¹日本茨城筑波大学综合与全球专业学院人类生物学博士课程。
²日本茨城筑波大学筑波高级研究联盟生命科学中心。
^三日本茨城筑波大学生命与环境科学研究生院。
⁴日本茨城筑波筑波大学筑波高级研究联盟生命科学中心akif@tara.tsukuba.ac.jp。

PMID： 27994012
预防性维修识别码：项目编号5335503
内政部： 10.1128/MCB.00504-16

不对称精氨酸二甲基化调节秀丽隐杆线虫线粒体能量代谢和平衡

梁莎等。分子细胞生物学. 2017.

.2017年3月1日；37（6）：e00504-16。

doi:10.1128/MCB.00504-16。 2017年3月15日印刷。

作者

梁莎¹, Hiroaki Daitoku公司², Sho Araoi公司^三, 金谷裕太^三, 尤塔·高桥², Koichiro Kako先生^三, 福田昭史⁴

附属公司

¹日本茨城筑波大学综合与全球专业学院人类生物学博士课程。
²日本茨城筑波大学筑波高级研究联盟生命科学中心。
^三日本茨城筑波大学生命与环境科学研究生院。
⁴日本茨城筑波筑波大学筑波高级研究联盟生命科学中心akif@tara.tsukuba.ac.jp。

PMID： 27994012
预防性维修识别码：项目编号5335503
内政部： 10.1128/MCB.00504-16

摘要

蛋白精氨酸甲基转移酶1（PRMT-1）催化细胞蛋白上的不对称精氨酸二甲基化，并调节生物过程的各个方面，如信号转导、DNA修复和转录调控。我们之前报道过第1批在里面秀丽隐杆线虫生命周期略有缩短，但PRMT-1的生理意义仍不清楚。在这里，我们探索了PRMT-1在线粒体功能中的作用，这是一项基于二维蛋白质印迹的蛋白质组研究所暗示的。亚细胞分离和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析表明，PRMT-1几乎完全负责线粒体蛋白质上的不对称精氨酸二甲基化。重要的是，从第1批突变体代表ATP合成受损在体外和全身呼吸第1批突变体减少体内转基因拯救实验表明，PRMT-1依赖的不对称精氨酸二甲基化是防止线粒体活性氧（ROS）产生所必需的，从而导致线粒体未折叠蛋白反应的激活。此外第1批由于线粒体功能障碍导致食物回避行为，但使用抗氧化剂进行治疗N个-乙酰半胱氨酸显著改善了这种表型。这些发现为线粒体功能的翻译后调节增加了一层新的复杂性，并为理解PRMT-1在多细胞生物中的生理作用提供了线索。

关键词：秀丽隐杆线虫；PRMT-1；不对称精氨酸甲基化；线粒体。

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数字

图1
结合Sypro-Ruby蛋白染色和Western印迹以及两种不同的抗ADMA抗体的二维（2-D）蛋白质组分析。（A） 2-D Western blotting用于识别秀丽隐杆线虫PRMT-1底物的工作流程示意图。简单地说，野生型N2或*第1批*对突变蠕虫进行2-D-PAGE，并用抗ADMA抗体进行印迹。从Sypro Ruby染色凝胶中挑选出N2特异性斑点，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定。（B）从N2或*第1批*用2-D PAGE分离成虫第1天的突变蠕虫，然后用ASYM24（顶面板）或ASYM26（中间面板）抗体进行Western blotting。在与Sypro Ruby染色凝胶（底部面板）合并后，用抗ADMA抗体（用箭头和数字表示）检测到的N2特异性斑点被手动挑选出来用于MALDI-TOF MS分析。MW，分子量（单位：千）。

图2
线虫线粒体蛋白质的不对称精氨酸二甲基化需要PRMT-1。（A） N2或N2全细胞提取物的线粒体分离*第1批*变异蠕虫。用抗ATP-2（线粒体标记）、H3（核标记）、微管蛋白（细胞质标记）或PRMT-1的抗体对每个组分进行印迹。TL，总裂解物；LM，轻线粒体；HM，重线粒体；PMS，线粒体后上清液。（B）线粒体组分中ADMA和SDMA水平的测定。来自N2或*第1批*将突变蠕虫进行酸性水解，然后用LC-MS/MS进行分析。

图3
损失*第1批*导致线粒体ATP合成受损。（A）*在体外*ATP测定。从N2或*第1批*用抗H28O16.1（ATP合成酶α亚单位）或抗ATP-2抗体印迹突变蠕虫。（B）不同底物的供应与氧化磷酸化偶联。用于*在体外*ATP分析以灰色突出显示。谷氨酸；琥珀酸盐；α-KG，α-酮戊二酸；富马酸，富马酸；C I至C V，配合物I至V；ETF，电子转移黄素蛋白；细胞色素*c（c）*分离线粒体的（C至F）ATP合成在*第1批*与N2（开放条）相比，零突变（填充条）。提供不同的底物组合，通过以下方法测量ATP合成*在体外*ATP测定。误差条表示三个独立实验的±SEM。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*< 0.001.

图4
损失*第1批*降低秀丽线虫的耗氧速率。在N2和*第1批*变异蠕虫。误差条表示四个独立实验的±SEM。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01.

图5
PRMT-1以酶活性依赖的方式阻止线粒体ROS的生成。氮气，*prmt-1型*,*第1批*;*示例71*[*第1批*(+)]，或*prmt-1型*;*排除84*[*prmt-1G70A型*(+)]成虫第1天用线粒体超氧化物指示剂MitoSOX染色，并用荧光显微镜观察。显示了具有代表性的显微镜图像（原始放大倍数，×400）。DIC，不同的干扰对比度。

图6
损失*第1批*诱导线粒体中未折叠的蛋白质反应。（A和B）敲除*第1批*诱导线粒体应激报告器中GFP的表达*zcIS13型*[*Phsp6型*::*绿色荧光粉*]应变。用对照L4440或*第1批*L4期RNAi载体。用荧光显微镜（a）观察GFP在F1代的表达，并用抗GFP抗体（B）进行Western blotting证实。（C）线粒体活性氧*第1批*通过抗氧化剂处理，突变体减少。*第1批*H上生长的突变体₂补充O或NAC的平板用MitoSOX染色，并用荧光显微镜观察。（D） NAC治疗可降低UPR^公吨由引起*prmt-1型*击倒。*第1批*在H上执行击倒₂O型和NAC补充的RNAi板。荧光显微镜下观察GFP的表达。箭头表示咽球。

图7
酶活性丧失*第1批*诱导食物回避行为。（A）*第1批*突变体和*网络服务提供商-1*与对照相比，击倒蠕虫表现出回避食物的行为。N2或*第1批*对照L4440或*网络服务提供商-1*RNAi板（右）。（C）食物回避表型在*第1批*突变体是通过酶活性而非非活性来拯救的，*第1批*转基因回复子。N2的代表性图像，*第1批*,*第1批*;*示例71*[*第1批*(+)]，或*第1批*;*排除84*[*prmt-1G70A型*(+)]蠕虫。箭头表示草坪外的蠕虫。（E）食物回避表型在*第1批*线粒体应激监测基因沉默可抑制突变。N2或*第1批*以对照L4440为食的突变蠕虫，*英寸-17*，或*thoc-2型*显示了RNAi板。箭头表示草坪外的蠕虫。（B、D、F）分别在面板A、C、E中说明的避免进食表型的量化结果。面板F、N2和*第1批*突变体分别由开放条和填充条表示。误差条表示三个独立实验的±SEM。*不适用*.,*P（P）*> 0.05; *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*< 0.001.

图8
NAC治疗取消了*第1批*突变体。（A）抗氧化剂治疗部分挽救了*第1批*突变体。N2或*第1批*图中显示了在水或添加NAC的分析板上饲养的突变动物。箭头表示草坪外的蠕虫。（B）面板A.N2和*第1批*突变体分别由开放条和填充条表示。误差条表示三个独立实验的±SEM。**，*P（P）*< 0.01.

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[10] 贝德福德MT，克拉克SG.2009。哺乳动物的蛋白质精氨酸甲基化：谁、什么以及为什么。分子细胞33:1–13。doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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