Integrin-FAK signaling rapidly and potently promotes mitochondrial function through STAT3

doi:10.1186/s12964-016-0157-7

.2016年12月15日；14(1):32.

doi:10.1186/s12964-016-0157-7。

整合素-FAK信号通过STAT3快速有效地促进线粒体功能

Nishant P Visavadiya公司¹, 马修·P·凯西¹, 弗拉迪斯拉夫·拉兹斯卡佐夫斯基¹, 卡皮塔·班纳吉¹, 贾翠红¹, 奇哈鲁·洛文斯¹, 加里·赖特¹, 西奥·哈格²

附属公司

¹东田纳西州立大学奎伦医学院生物医学系，地址：美国田纳西州约翰逊市枫叶大道178号楼，邮政信箱70582。
²东田纳西州立大学奎伦医学院生物医学系，地址：美国田纳西州约翰逊市枫叶大道178号楼，邮政信箱70582。haggt1@etsu.edu。

PMID： 27978828
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内政部： 10.1186/s12964-016-0157-7

整合素-FAK信号通过STAT3快速有效地促进线粒体功能

Nishant P Visavadiya公司等。小区通信信号. 2016.

.2016年12月15日；14(1):32.

doi:10.1186/s12964-016-0157-7。

作者

Nishant P Visavadiya公司¹, 马修·普·凯西¹, 弗拉迪斯拉夫·拉兹斯卡佐夫斯基¹, 卡皮塔·班纳吉¹, 贾翠红¹, 奇哈鲁·洛文斯¹, 加里·L·赖特¹, 西奥·哈格²

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¹东田纳西州立大学奎伦医学院生物医学系，地址：美国田纳西州约翰逊市枫叶大道178号楼，邮政信箱70582。
²东田纳西州立大学奎伦医学院生物医学系，地址：美国田纳西州约翰逊市枫叶大道178号楼，邮政信箱70582。haggt1@etsu.edu。

PMID： 27978828
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勘误表in

勘误表：整合素-FAK信号通过STAT3快速有效地促进线粒体功能。
Visavadiya NP、Keasey议员、Razskazovskiy V、Banerjee K、Jia C、Lovins C、Wright GL、Hagg T。 Visavadiya NP等人。小区通信信号。2017年3月27日；15(1):11. doi:10.1186/s12964-017-0167-0。小区通信信号。2017 PMID：28347299 免费PMC文章。没有可用的摘要。
更正：整合素-FAK信号通过STAT3快速有效地促进线粒体功能。
Visavadiya NP、Keasey议员、Razskazovskiy V、Banerjee K、Jia C、Lovins C、Wright GL、Hagg T。 Visavadiya NP等人。小区通信信号。2020年4月20日；18（1）：64。doi:10.1186/s12964-020-00577-y。小区通信信号。2020 PMID：32312272 免费PMC文章。

摘要

背景：STAT3因其S727残基（S727-STAT3）激活后对线粒体生物能量功能的非转录调节而日益为人所知。长时间线粒体功能障碍可导致细胞死亡。我们测试了我们最近发现的整合素FAK-STAT3信号通路是否调节线粒体功能和细胞存活及其治疗。

方法：用整合素、FAK或STAT3抑制剂、FAK-siRNA以及整合素和STAT3活化剂处理培养的小鼠脑bEnd5内皮细胞。用突变的STAT3质粒转染STAT3空细胞。结果测量包括线粒体生物能量学的耗氧率、蛋白质磷酸化的Western blotting、线粒体完整性的线粒体膜电位、ROS生成和细胞计数。

结果：RGD和αvβ3整合素拮抗肽在4 h内抑制了依赖于Vitronectin的线粒体基础呼吸、ATP生成、最大储备和呼吸能力。相反，整合素配体卵黄凝集素、层粘连蛋白和纤维连接蛋白刺激线粒体功能。药物抑制FAK在4小时内完全消除线粒体功能，而FAK siRNA治疗证实了FAK信号的特异性。WT，而非S727A功能性死亡突变体STAT3，使用CRISPR-Cas9挽救了STAT3无效细胞中的生物能量学。用stattic抑制整个细胞中的STAT3迅速降低线粒体功能和线粒体pS727-STAT3。对分离的线粒体进行静态处理并没有降低pS727，而在磷酸酶抑制时检测到更多。这表明S727-STAT3在细胞质中被激活，并在转位到线粒体时短暂存在。FAK抑制降低线粒体内的pS727-STT3，并以非转录方式降低线粒体功能，如与放线菌素共同处理所示。间接激活S727-STAT3的小分子苔藓蛋白-1或肝细胞生长因子（HGF）治疗在FAK抑制期间保留了线粒体功能，但在STAT3抑制剂存在的情况下失败。FAK的抑制导致线粒体膜电位的丧失，而bryostatin可以抵消这种损失，并增加超氧化物和过氧化氢的产生。Bryostatin和HGF在24小时内减少了由FAK抑制引起的大量细胞死亡。

结论：这些数据表明，细胞外基质分子通过整合素-FAK信号传导促进STAT3依赖的线粒体功能和细胞存活。我们进一步展示了一种使用S727-STAT3激活剂的细胞存活新治疗策略。

关键词：生物能量学；CRISPR；细胞死亡；ECM；内皮细胞；粘着斑激酶；整合素；线粒体；STAT3；玻璃体凝集素。

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数字

图1
RGD和αvβ3整合素阻断抑制线粒体生物能量学。一根据XF24海马通量分析仪中的耗氧量（OCR）测量，从一个代表性实验中获得的痕迹表明，在无血清培养基中存在RGD整合素（RGDS）或αvβ3整合素阻断肽的情况下，在小鼠脑bEnd5细胞上镀上卵黄凝集素（VTN）后的线粒体生物能量缺乏。数据是每种情况下5口井的平均值。b条与对照组（无VTN）和VTN处理细胞相比，整合素阻断降低了细胞呼吸的所有四项指标。**c（c）**在XF24微孔板中无底物或在VTN上培养4h的细胞，无论有无整合素阻断，其数量似乎相似，但无底物和RGDS存在的细胞更圆。单元格编号(d日)和蛋白质含量(电子)在这些细胞中，在没有后续Seahorse分析的情况下测定，在所有条件下都没有显著差异。独立验证细胞计数。**（f）**以VTN、层粘连蛋白（LAM）或纤维连接蛋白（FN）为底物培养4h，并添加到无血清培养基中的细胞显示线粒体生物能量增加。所有数据均为平均值 ± 3-4个独立实验的SEM**第页 <* 0.05,**第页 < 0.01，以及***第页 < 0.001

图2
FAK抑制导致线粒体功能障碍。一整合素信号分子FAK的药理学抑制，以及FAK14对bEnd5细胞的治疗4小时，产生了对线粒体生物能量功能的强健和剂量依赖性抑制，如典型的OCR轨迹所示。处理前，细胞在无底物的情况下生长44小时。b条FAK14导致基础呼吸、ATP生成、最大储备和呼吸容量减少。单元格编号(**c（c）**)和蛋白质含量(d日)不同条件下没有差异。对细胞计数进行了独立验证。电子与非靶向SiRNA对照（siControl）相比，SiRNA介导的FAK基因敲除（siFAK）降低了ATP生成、储备能力和呼吸能力。数据均为平均值 ± 来自3个独立实验的SEM**第页 <* 0.05时***第页 <* 0.01,***第页 < 0.001纳秒 = 与对照组相比不显著

图3
S727-STAT3抑制导致线粒体功能障碍。一野生型（WT）表达质粒，但不是功能性死亡的S727A突变体，STAT3通过CRISPR-Cas9方法增加了bEnd5细胞的生物能量学功能，呈现STAT3−/−。N个 = 三。b条western blot证实STAT3蛋白的缺失在转染G1A引导RNA的细胞中最为明显（G1A和G1B是相同Cas9-guideRNA质粒的复制条件），用于（A）中的生物能量学实验。**c（c）**DNA序列数据证实了外显子1的点突变和帧移位。d日在bEnd5细胞中用static对STAT3进行2小时的药理学抑制可降低线粒体生物能量测定值。n个 = 三。电子pS727-STAT3主要存在于线粒体和细胞核中，如亚细胞组分蛋白质提取物的Western blots所示。标记 = H3蛋白、细胞核（N）、α-微管蛋白、细胞质（C）、PDH、线粒体（M）。W公司 = 全细胞裂解。t状态3 = 总STAT3。**（f）**用STAT3抑制剂stattic（10μM）处理4h的细胞，其分离线粒体中的pS727-STAT3较少。克western blotting检测到，在呼吸缓冲液中用冈田酸（OA:1μM）处理的分离的bEnd5线粒体中，pS727-STAT3增加（显示了3个独立的实验）。Stattic没有任何作用。OA处理后，pS727-STAT3印迹中出现了一条分子量较高的条带。长时间暴露总STAT3印迹后，在相同位置可以看到一条微弱的条带（未显示）

图4
FAK抑制线粒体S727-STAT3磷酸化。一对bEnd5细胞进行4小时FAK14处理后，线粒体和细胞质部分的pS727-STAT3均降低。印迹是5个实验的代表。b条通过具有代表性的化学发光光谱图和合成带的定量毛细管western印迹证实了这种减少(**c（c）**).d日对光谱图进行定量分析，证实FAK14处理4 h后线粒体部分pS727-STAT3明显显著降低(n个 = 3).电子用另一种更亲脂的FAK拮抗剂（PF573228:PF，10或20μM）处理4或8小时后，pS727-STAT3降低，同时全细胞裂解液中的pFAK降低。**（f）**在控制或FAK14条件下，与全局转录抑制剂放线菌素D（0.3μg/ml，4 h）孵育不会显著改变线粒体生物能量学

图5
pS727-STAT3刺激保护线粒体生物能量学对抗FAK抑制。一Bryostatin和HGF在与FAK14（5μM，F5）孵育4小时的bEnd5细胞中保持储备和呼吸能力。数据均为平均值 ± 来自3个独立实验的SEM**第页 <* 0.05,**第页 < 0.01,**第页 < 0.001.b条全细胞裂解物的Western blot显示，在FAK14存在下，苔藓抑制素（BST）和HGF保存pS727-STAT3（代表3个独立实验）。**c（c）**Bryostatin不影响STAT3与stattic抑制引起的线粒体生物能量学功能障碍。N个 = 三

图6
Bryostatin和HGF可减少FAK抑制导致的bEND5细胞死亡。一图像代表了在常规组织培养孔中用5μM FAK14+/-bryostatin（BST）培养4h的bEnd5细胞。b条到电子)细胞计数显示，尽管FAK被5或10μM FAK14抑制4或24小时，但苔藓抑制素和HGF仍能促进存活。数据均为平均值 ± 来自3个独立实验的SEM*第页 < 0.05时**第页 < 0.01和***第页 < 0.001

图7
FAK抑制降低线粒体膜电位并增加ROS生成。一用FAK14抑制FAK 4小时，导致线粒体膜电位的剂量依赖性降低，如bEnd5细胞中红色TMRM荧光的共焦图像所示。箭头表示线粒体完全失效的细胞，只有蓝色核Hoechst染色才能检测到。b条利用提取物中TMRM的光谱测定来量化其影响，并表明10μM FAK14（FAK10）将膜电位降低至与FCCP相同的水平。将数值归一化为细胞核DAPI染色，以解释细胞数量的差异。数据均为平均值 ± 来自3个独立实验的SEM**第页 <* 0.05,**第页 < 0.01,***第页 < 0.001.c（c）在FAK14存在下，Bryostatin（BST）剂量依赖性地保护线粒体膜电位。N个 = 3.FAK14剂量依赖性诱导d日)超氧化物（O₂ ^.-)和电子)H（H）₂O（运行）₂.N个 = 三

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