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.2017年2月15日；28(4):545-553.
doi:10.1091/mbc。E16-09-0628。 Epub 2016年12月14日。

Fidgetin通过切断前缘的酪氨酸化微管来调节培养的星形胶质细胞迁移

尊鲁湖 1, 杰峰 1, 魏娟波 1, 吴荣华 1, 张吉栋 1, 刘燕（Yan Liu） 1, 梁强 2 三, 刘梅（音） 2
附属公司

Fidgetin通过切断前缘的酪氨酸化微管来调节培养的星形胶质细胞迁移

尊鲁湖等。 分子生物学细胞. .

摘要

微管（MT）的组织对于许多细胞事件至关重要，包括有丝分裂、迁移和细胞极性。Fidgetin（图）是一种依赖ATP的MT覆盖蛋白，通过切割和修剪MT聚合物来调节MT构型。Fign在神经突起生长、有丝分裂、减数分裂和细胞迁移中的功能已被证实。这里我们关注星形胶质细胞的迁移。我们发现Fign通过优先靶向富含酪氨酸化微管蛋白的MT（或MT区域）在培养的星形胶质细胞迁移中发挥重要作用，这是一种特别动态MT或MT特别动态区域的标记物。Fign基因敲除诱导的细胞迁移抑制可以通过同时敲除驱动蛋白-12（一种以其在有丝分裂中的作用而闻名的运动蛋白）来缓解。我们提出了一种新的工作模型，用于研究由两种不同的MT相关蛋白的功能合作引起的细胞迁移中的MT重构。

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数字

图1：
图1：
Fign的耗尽抑制了大鼠培养的星形胶质细胞的迁移。（A） 通过qRT-PCR检测Fign-siRNA处理培养的星形胶质细胞24小时的效率。数据显示为平均值±SE。对照（Ctrl）siRNA处理的星形胶质细胞的相对mRNA水平标准化为1，图中siRNA=0.27±0.04；n个= 3, **第页< 0.01. （B） Western blotting检测Fign siRNA在培养的星形胶质细胞中处理72 h的效率。左，代表性Western印迹；对，量化。数据显示为平均值±SE。Ctrl-siRNA处理的星形胶质细胞的相对蛋白水平标准化为1，图中siRNA=0.48±0.06；n个= 4, *第页< 0.05. （C） 用Ctrl-siRNA和Fign-siRNA.Bar处理72小时后转移培养的星形胶质细胞的典型Transwell结晶紫染色（红色）图像，100μm。对，统计分析显示迁移的细胞数量；数据显示为平均值±SE。控制siRNA=143.2±17.29，图siRNA=75.1±9.93，n个＝5**第页< 0.01. （D） 左图，siRNA处理72小时后星形胶质细胞增殖的EdU染色的代表性图像；对，统计分析显示Ctrl-siRNA和Fign siRNA处理之间没有显著差异。红色（EdU染色），增殖细胞；蓝色（Hoechst染色），细胞总数。棒材，100μm。数据显示为平均值±标准误差。控制siRNA=0.43±0.11，图siRNA=0.35±0.09，n个= 5; ns，无显著性；第页> 0.05. （E） 用Ctrl-siRNA或Fign-siRNA转染的左、上、星形胶质细胞按材料和方法然后每隔10分钟成像一次。左下方是每组随机选取的四个单元的轨迹，显示单元的迁移长度（总轨迹距离）和方向迁移距离（从起点到终点）。右上方，Ctrl-siRNA和Fign-siRNA处理细胞的迁移长度。数据显示为平均值±SE，n个=三个独立实验中每种条件下28个细胞，Ctrl-siRNA=270±10.0μm，Fign-siRNA=160.0±42.03μm*第页< 0.05. Ctrl和Fign siRNA处理细胞的右下方向迁移距离。数据表示为平均值±SE，n个=三个独立实验中每种条件下26个细胞，Ctrl-siRNA=43±3.3μm，Fign-siRNA=20.00±4.0μm**第页< 0.01.
图2：
图2：
Fign的过度表达降低了星形胶质细胞中的tyr-MT。（A） 切断MT的代表性图像。将LV-5-慢病毒导入星形胶质细胞3d，并用抗α-微管蛋白进行免疫染色，将LV-5-katanin慢病毒用作切断MT的功能对照。未观察到MT切断，LV5-Fign处理的星形胶质细胞中未发现短MT片段，但在LV5-katanin-P60过度表达细胞组中发现了多个MT（左下；条形，20μm）。右下角，分离MTs的放大。（B）顶部，代表性的Western blotting结果显示，LV5-Fign-过表达培养物的酪氨酸-管蛋白与α-管蛋白的比率低于LV5-NC培养物。底部，统计数据显示在Fign过度表达后，酪氨酸-管蛋白减少。数据显示为平均值±SE。LV-NC-过度表达星形胶质细胞的相对酪氨酸-管蛋白水平（α-微管蛋白作为对照）标准化为1。LV5-图=0.48±0.04，n个= 3, *第页< 0.05. （C） LV5-Fign过度表达对修饰微管蛋白的影响。用LV5-NC（阴性对照；NC）或LV5-Fign慢病毒处理3 d的星形胶质细胞被固定，并用酪蛋白（红色）和α-微管蛋白（绿色）进行免疫染色。与LV5-NC处理的星形胶质细胞（顶部）相比，在LV5-Fign（底部）的Fign过度表达组中未检测到短MT，但使用tyr-tubulin（白色箭头）的细胞边缘显著减少。棒材，20μm。
图3：
图3：
Fign的耗竭导致培养星形胶质细胞皮质区MT曲线异常，平行于质膜。（A） Fign蛋白在单个细胞中被敲除后显著降低。用Ctrl或Fign-siRNA处理培养的星形胶质细胞3d（bar，20μm）后，Fign抗体免疫染色的代表性上图。底部，量化数据显示为平均值±SE。Ctrl-siRNA处理的星形胶质细胞的相对荧光强度标准化为1。Fign siRNA=0.52±0.05，n个＝30**第页< 0.01. （B） 上图为经Ctrl-siRNA或Fign-siRNA处理的星形胶质细胞中α-微管蛋白抗体免疫染色的代表性图像。与Ctrl组微管蛋白骨架无明显变化相比，Fign的敲除导致细胞边缘的MT弯曲（白色箭头表示皮质区的MT弯曲；巴，20μm。左下方，MT弯曲细胞与Ctrl或Fign siRNA处理后总细胞的比率；数据显示为平均值±标准误差。控制siRNA=0.27±0.03，图siRNA=0.96±0.04，n个= 18, **第页< 0.01. 右下方，Ctrl或Fign siRNA处理后弯曲MT的弧长与细胞周长的比值；数据显示为平均值±标准误差。控制siRNA=0.16±0.03，图siRNA=0.60±0.03，n个= 18, **第页< 0.01.
图4：
图4：
Fign的消耗增加了培养星形胶质细胞皮质区的tyr-MT。（A） 左图为用Ctrl-siRNA和Fign-siRNA处理过的表达α-微管蛋白（绿色）和酪氨酸-微管蛋白质（红色）的星形胶质细胞的代表性图像。与Ctrl组相比，Fign的耗竭导致细胞皮层区域中的MT弯曲，这些MT主要由酪氨酸-tubulin组成。棒材，20μm。右上角，酪蛋白相对荧光强度的量化。与Ctrl-siRNA处理的细胞相比，Fign-siRNA增加了酪氨酸-管蛋白质量。数据显示为平均值±SE。Ctrl-siRNA-处理的星形胶质细胞的相对荧光强度标准化为1。图中siRNA=1.42±0.14，n个= 18, *第页< 0.05. （B） 典型的Western印迹结果。与Ctrl-siRNA处理相比，Fign-siRNA在第3天的处理增加了酪蛋白的比率。数据以平均值±SE表示。Ctrl-siRNA处理的星形胶质细胞的相对酪氨酸-管蛋白水平（α-微管蛋白作为对照）标准化为1。图中siRNA=1.46±0.22，n个= 4, *第页< 0.05. （C） 顶部，星形胶质细胞用Ctrl或Fign siRNA处理3天，固定，并对去酪氨酸或乙酰化微管蛋白进行免疫染色。为了进一步说明Fign缺失降低了酪氨酸微管蛋白的质量，选择去酪氨酸和乙酰化微管蛋白作为对照。棒材，20μm。底部，定量，Ctrl-siRNA处理的星形胶质细胞的相对荧光强度标准化为1。去酪氨酸化微管蛋白（左下图；图中siRNA=1.09±0.07）或乙酰化微管蛋白质（右下图；图上siRNA=1.14±0.06）的变化无显著差异。n个= 30; ns，不显著；第页>0.05之间。
图5：
图5：
激动素-12的缺失减少了MT异常弯曲并挽救了细胞迁移。（A） 不同修饰微管蛋白对驱动蛋白-12蛋白的定殖分析。星形胶质细胞在玻璃盖玻片上培养。24小时后，将细胞固定，并通过乙酰化、去酪氨酸化或酪氨酸化的微管蛋白和驱动蛋白-12抗体进行免疫染色。顶部的代表性图像显示驱动蛋白-12抗体与乙酰基微管蛋白、脱乙酰基微管蛋白或Tyr微管蛋白抗体的免疫染色结果。棒材，40μm。为了确定共同定位的程度，皮尔逊的统计分析第页利用ImageJ对驱动蛋白-12和微管蛋白的不同修饰进行相关性量化。Kinesin-12与富含酪氨酸-管蛋白（0.64±0.04）的MT共定位，其含量超过了去乙酰化管蛋白（0.40±0.02）和乙酰化管素（0.40？.03）；n个= 30; ns，不显著**第页< 0.01. （B） Fign缺失3d后星形胶质细胞中驱动蛋白-12位置的代表性图像。免疫荧光结果显示，驱动蛋白12的模式一致，随后是可变微管蛋白，尤其是在Fign siRNA处理后的细胞边缘，MT弯曲或捆绑（白色箭头）。（C） 驱动蛋白-12对MT弯曲的影响。左图为用Ctrl-siRNA、Fign-siRNA或Fign-si RNA加上驱动蛋白-12 siRNA处理的星形胶质细胞中α-微管蛋白抗体的免疫染色代表性图像。用Fign和驱动蛋白12双重敲除可以部分修复MT弯曲。在Ctrl组，MT垂直于细胞边缘，而在Fign siRNA组，MT平行于细胞边缘。图12和驱动蛋白12的双重缺失可恢复MT弯曲（红线表示弯曲部分）。棒材，20μm。中等，在Ctrl或Fign siRNA或Fign-siRNA加上驱动蛋白-12 siRNA处理后，MT弯曲的细胞与总细胞的比率。数据显示为平均值±标准误差。控制siRNA=0.22±0.01(n个= 20); 图中siRNA=0.88±0.06(n个= 15); 图siRNA加驱动蛋白-12 siRNA=0.39±0.05(n个= 20), **第页< 0.01. 右，Ctrl、Fign siRNA或Fign siRNA加上驱动蛋白-12 siRNA处理后弯曲MT的弧长与细胞周长的比值。数据显示为平均值±SE。Ctrl-siRNA=0.16±0.01；图中siRNA=0.58±0.04；Fign siRNA加上驱动蛋白-12 siRNA=0.25±0.01；n个= 30, **第页< 0.01. （D） 左图为伤口愈合的代表性图像。Kinesin-12缺失可缓解因Fign蛋白敲除（bar，100μm）引起的细胞迁移缺陷。右，Ctrl、Fign-siRNA、Fign siRNA加上驱动蛋白-12 siRNA治疗后进入伤口区域的细胞数。数据显示为平均值±SE。Ctrl-siRNA=60.0±6.67，Fign-siRNA=33.3±2.40，Fign-siRNA加上驱动蛋白-12-siRNA=52.7±2.41；n个= 3, *第页< 0.05.
图6：
图6：
Fign如何调节培养迁移星形胶质细胞中细胞皮层区域不稳定MT长度的模型。Fign通过靶向富含酪氨酸微管蛋白的MT，在培养的星形胶质细胞迁移中发挥作用。当Fign存在时，细胞皮质区富含酪氨酸化微管蛋白的不稳定MT可以被适当修剪，并保持垂直于质膜，细胞能够根据细胞外信号移动。当Fign耗尽时，由于驱动蛋白-12的滑动力，这些不稳定的MT变得弯曲平行于质膜，因此细胞运动显著减少。如果驱动蛋白-12蛋白与Fign一起被耗尽，则由驱动蛋白-12和肌球蛋白IIB相互作用产生的滑动力被释放。细胞迁移可以部分挽救。
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