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.2017年6月;21(6):1159-1170.
doi:10.1111/jcmm.13047。 Epub 2016年12月13日。

MiR-199b-5p通过靶向JAG1和调节Notch信号通路抑制黄韧带细胞的成骨分化

附属公司

MiR-199b-5p通过靶向JAG1和调节Notch信号通路抑制黄韧带细胞的成骨分化

瞿晓晨等。 细胞与分子医学杂志. 2017年6月.

摘要

黄韧带骨化(OLF)是一种病理学现象,几乎只在东亚国家有报道。OLF的主要病因是胸椎管狭窄和脊髓病。本研究检测了miR-199b-5p和锯齿状1(JAG1)在初级黄韧带细胞成骨中的作用。在黄韧带细胞的成骨分化过程中发现MiR-199b-5p表达下调,而MiR-199b-5%p过度表达则抑制成骨分化。此外,发现JAG1在黄韧带细胞的成骨分化过程中上调,而通过RNA干扰敲低JAG1导致Notch信号传导和成骨分化受到抑制。此外,靶点预测分析和双荧光素酶报告子分析支持JAG1是miR-199b-5p的直接靶点的观点,发现miR-199b-5p下调JAG1和Notch。此外,JAG1敲除被证明可以阻断miR-199b-5p抑制的作用。这些发现表明,miR-199b-5p通过潜在靶向JAG1和影响Notch信号通路,在黄韧带细胞的成骨分化中发挥抑制作用。

关键词:JAG1;Notch信号通路;miR-199b-5p;黄韧带骨化;成骨分化。

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数字

图1
图1
OLF患者黄韧带细胞的鉴定和表征。(A类)获得具有代表性的OLF患者黄韧带样本通过整块切除椎板和黄韧带。一般样本(a)、计算机断层扫描(b)和磁共振成像(c),包括相应位置骨化区域的矢状面和跨平面扫描。(B类)P0和P1 OLF患者黄韧带细胞的典型形态。(C类)OLF细胞波形蛋白的免疫细胞化学检测;比例尺代表200μm。(D类)OLF患者黄韧带细胞五种成骨标志物的qRT-PCR分析*P(P)与第0天相比<0.05 C。(E类)OLF患者黄韧带细胞ALP活性及茜素红染色;比例尺代表200μm。
图2
图2
MiR‐199b‐5p抑制黄韧带细胞中的成骨作用。(A类)测定内源性miR‐199b‐5p表达水平通过黄韧带细胞成骨分化过程中不同时间点的qRT‐PCR*P(P)与第0天相比<0.05。(B类)MiR‐199b‐5p表达评估通过miRNA模拟物转染黄韧带细胞的qRT‐PCR*P(P)与miR-NC组相比<0.05。(C类)第14天miR‐199b‐5p过度表达后成骨标志基因的qRT‐PCR分析*P(P)与miR‐NC组相比,<0.05。(D类)第14天miR‐199b‐5p过度表达后成骨标志蛋白表达的Western blot分析。(E类)第14天的ALP染色和茜素红染色显示,与miR‐NC相比,miR-199b‐5p过度表达后,ALP活性和钙化受到抑制;比例尺表示200μm。
图3
图3
JAG1敲除下调Notch信号并抑制黄韧带细胞的成骨分化。(A、 B类)检测JAG1 mRNA和蛋白表达水平通过黄韧带细胞成骨分化过程中不同时间点的qRT-PCR和Western印迹*P(P)与第0天相比<0.05。(C、 D类)检测JAG1 mRNA和蛋白表达水平通过siJAG1转染黄韧带细胞后的qRT-PCR和Western blot*P(P)与si-NC组相比<0.05。(E类)检测Notch1和Notch2蛋白表达水平通过siJAG1转染黄韧带细胞的Western blot。(F、 G公司)检测成骨标志物mRNA和蛋白表达通过JAG1敲除后第14天的qRT‐PCR和Western blot*P(P)与si-NC组相比<0.05。(H(H))与miR‐NC组相比,第14天的ALP染色和茜素红染色显示JAG1敲除后抑制了ALP活性和钙化;比例尺代表200μm。
图4
图4
MiR‐199b‐5p直接瞄准JAG1并影响Notch信号。(A类)JAG1 3′-UTR中的miR‐199b‐5p结合位点在脊椎动物中高度保守。(B类)示意图显示JAG1 3′-UTR中的野生型和突变型miR‐199b‐5p结合位点。(C类)用miR‐199b‐5p或mi-NC将野生型(WT)JAG1 3′-UTR或突变型(MUT)JAG13′-UTR报告质粒共转染到HEK293T细胞中,并对荧光进行量化*P(P)与miR‐NC组相比,<0.05。(D、 E类)检测JAG1 mRNA和蛋白表达水平通过miR‐199b‐5p转染黄韧带细胞后的qRT‐PCR或Western blot。(F类)检测Notch1和Notch2蛋白表达水平通过miR‐199b‐5p转染黄韧带细胞的Western blot。(G公司)TGFB2和SOX6的3′-UTR中的MiR‐199b‐5p结合位点在脊椎动物中高度保守。(H(H))用miR‐199b‐5p或mi-NC在HEK293T细胞中共转染TGFB2 3′-UTR或SOX6 3′-URT报告质粒,并对荧光进行量化*P(P)与miR-NC组相比<0.05。
图5
图5
JAG1敲除可阻断miR‐199b‐5p抑制作用。(A类)评估了MiR‐199b‐5p的表达通过miRNA抑制剂转染黄韧带细胞的qRT-PCR*P(P)与miR‐NC‐I组相比,<0.05。(B类)检测JAG1 mRNA表达水平通过miR‐199b‐5p抑制剂和siJAG1转染黄韧带细胞后的qRT‐PCR#P(P)与“miR‐199b‐5p‐I+si‐NC”组相比,<0.05。(C类)检测JAG1、Notch1和Notch2蛋白表达水平通过miR‐199b‐5p抑制剂和siJAG1转染黄韧带细胞后的Western blot。(D、 E类)检测成骨标志物mRNA和蛋白表达通过miR‐199b‐5p抑制剂和siJAG1转染后第14天的qRT‐PCR和Western blot*P(P)<0.05与“miR‐NC‐I”组相比#P(P)与“miR‐199b‐5p‐I+siNC”组相比,<0.05。(F类)miR‐199b‐5p抑制剂和siJAG1转染后第14天的ALP染色和茜素红染色;比例尺代表200μm。
图6
图6
GSK‐3β/β‐catenin调节JAG1,并受黄韧带细胞中miR‐199b‐5p的轻微影响。(A、 B类)检测GSK-3β和β-catenin mRNA和蛋白表达水平通过黄韧带细胞成骨分化过程中不同时间点的qRT-PCR和Western blot*P(P)与第0天相比<0.05。(C、 D类)检测GSK-3β和β-catenin蛋白表达水平通过黄韧带细胞中miR‐199b‐5p模拟物和抑制剂转染后的蛋白质印迹。(E、 F类)检测GSK-3β、β-catenin和JAG1 mRNA表达水平通过黄韧带细胞中GSK-3β和β-catenin被击倒后的qRT-PCR*P(P)与si-NC组相比<0.05。(G、 H(H))检测GSK-3β、β-catenin、JAG1 Notch1和Notch2蛋白表达水平通过黄韧带细胞中GSK-3β和β-catenin敲低后的Western blot。()本研究中黄韧带细胞成骨分化的调控机制抑制;'↓’: 促进;'×':弱效应。

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