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.2016年12月9日；11(1):76.
doi:10.1186/s13024-016-0141-0。

ULK1介导的ATG14磷酸化促进自噬并在亨廷顿病模型中受损

米切尔·S·沃尔德 1, 林俊贤 1 2, Véronik Lachance公司 1, 邓志强 1 3, 岳振宇 4 5
附属公司

ULK1介导的ATG14磷酸化促进自噬并在亨廷顿病模型中受损

米切尔·S·沃尔德等。 摩尔神经变性剂. .

摘要

背景：自噬是长寿命蛋白质、蛋白质聚集体和受损细胞器的大量降解途径。ULK1蛋白激酶和Vps34脂激酶是两个关键的自噬调节因子，对自噬体的生物发生至关重要。然而，ULK1如何调节Vps34尚不完全清楚，尤其是在疾病背景下。亨廷顿蛋白（Htt）中的聚谷氨酰胺扩张导致聚集蛋白的异常积累，并破坏各种细胞途径，包括自噬（溶酶体降解途径），这是亨廷顿病（HD）发病机制的基础。尽管Htt聚集物的自噬清除作为HD的治疗策略正在研究中，但自噬损伤的确切机制仍不清楚。此外，由于缺乏可靠和稳健的分子生物标记物，体内自噬检测尤其具有挑战性。

方法：我们制备了抗磷酸化ATG14抗体来检测ATG14介导的自噬调节；我们利用亨廷顿病（HD）遗传细胞模型和动物模型以及自噬报告动物模型来了解体内自噬信号和调节。我们应用生化分析和分子生物学方法来剖析自噬激酶活性和调节的变化。

结果：在这里，我们证明ULK1以mTOR依赖的方式磷酸化丝氨酸29处的ATG14。这种磷酸化严重调节ATG14-Vps34脂激酶活性，以控制自噬水平。我们还发现，在亨廷顿病Q175小鼠模型中，ATG14相关的Vps34活性和ULK1介导的ATG14和Beclin 1磷酸化受到损害。最后，我们发现在蛋白酶体抑制引起的一般蛋白毒性应激期间，ATG14磷酸化降低。ATG14和Beclin 1特异性磷酸化的减少部分是通过p62诱导的ULK1固存到不溶性细胞部分来介导的。我们发现，ULK1水平升高和类磷突变体ATG14有助于清除细胞中的polyQ突变体。

结论：我们的研究确定了ULK1对ATG14-Vps34激酶活性的一种新的调节机制，它可以作为体内自噬活性的有价值的分子标记，也可以作为清除聚谷氨酰胺疾病蛋白的潜在治疗靶点。

关键词：ATG14；自噬；亨廷顿氏；ULK1；第34页。

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数字

图1
图1
ULK1在丝氨酸29处磷酸化ATG14。一用丝氨酸29的位置表示ATG14结构。ER定位所需的4C-ER–半胱氨酸重复序列。CCD–线圈域。BATS–BARKOR自噬体靶向序列。bATG14和ULK1的免疫共沉淀。Myc-ULK1和ATG14-GFP在HEK细胞中过度表达，并使用抗GFP的抗体进行抑制。c（c）使用ULK1和ATG14 a.a.20–73进行体外激酶测定的自体放射照片。Myc-ULK1 WT、KI或空载体在HEK细胞中过度表达，并用Myc抗体进行免疫纯化。从大肠杆菌中纯化ATG14 a.a.20–73 WT、S29A或S61A。髓鞘碱性蛋白（MBP）作为阳性对照。d日类似实验(c（c）)除了使用抗磷酸化丝氨酸29的抗体。e（电子）在HEK细胞中联合转染ATG14-GFP和myc-ULK1 WT或KI。一半的IP在37°C下用碱性磷酸酶处理30分钟
图2
图2
自噬诱导后，ULK1以mTOR依赖方式磷酸化ATG14。一葡萄糖、血清或氨基酸戒断、HBSS中度饥饿或Torin 1治疗6小时后HCT116细胞中ATG14的磷酸化。b将ATG14磷酸化水平归一化为总ATG14水平，并与对照条件进行比较**第页 < 0.01 *第页 < 0.05 n.s.不显著(n个===========================================================================3). 数据表示为平均+/-SEM。c（c）HCT116细胞经Torin 1处理15、30、60和120分钟后ATG14磷酸化。d日将ATG14磷酸化水平归一化为总ATG14水平，并与对照条件进行比较。采用Bonferroni后测进行单因素方差分析。F（4，10）===========================================================================12.58,第页===========================================================================0.0006 ***第页 < 0.001 **第页 < 0.01 *第页 < 0.05 (n个===========================================================================3). 数据表示为平均+/-SEM。e（电子）用Torin 1或载体（DMSO）处理60分钟后，Beclin WT、KO或Beclin挽救的MEF细胞中的ATG14磷酸化。箭头表示pATG14带。（f）ATG14磷酸化的量化标准化为总ATG14**第页 < 0.01 (n个===========================================================================3). 数据表示为平均+/-SEM。克用Torin 1处理MEF WT和ULK1/2 DKO细胞60分钟。对ATG14进行免疫纯化，以增强磷酸硅。小时磷酸化-ATG14（S29）抗体特异性验证。中度饥饿或Torin 1处理60分钟后，ATG14 KO HCT116细胞中的ATG14磷酸化信号消失
图3
图3
ATG14磷酸化促进Vps34脂质激酶活性。一Vps34脂激酶测定。空载体或FLAG-ATG14 S29 WT、A或E突变体在HEK细胞中过度表达，并使用FLAG抗体将其拉下。bPI（3）P水平的量化标准化为IP中的Vps34水平。然后将值标准化为WT条件**第页 < 0.01 (n个===========================================================================5). 数据表示为平均+/-SEM。c（c）ATG14和Vps34复合物成员、Beclin 1、Vps34、Vps15和NRBF2的共免疫沉淀。空载体或FLAG-ATG14 S29 WT、A或E突变体在HEK细胞中过度表达，并使用FLAG抗体将其拉下。d日Torin 1处理不会改变Vps34复合物成员的结合。用Torin 1处理MEF细胞60分钟。使用抗ATG14抗体对细胞裂解物进行IP处理。e（电子）用Torin 1处理HCT116细胞15、30、60和120分钟后，Beclin 1和ATG14的磷酸化水平。（f）Vps34脂激酶检测Beclin 1和ATG14磷酸化突变的比较。使用FLAG抗体从HEK细胞过度表达和纯化Beclin 1-AsRed、FLAG-ATG14和双重myc-Vps34 his-Vps15质粒。克PI（3）P水平的量化标准化为IP中的Vps34水平。然后将值标准化为WT条件。利用Bonferroni后验进行双向方差分析，以确定突变性质和突变蛋白质的影响。Beclin 1或ATG14突变F（1，18）的主要作用===========================================================================4.08,第页===========================================================================0.0587; 突变类型F的主要影响（1,18）===========================================================================0.71,第页===========================================================================0.5043; 相互作用F（2，18）===========================================================================3.80,第页===========================================================================0.0421. **第页 < 0.01 (n个===========================================================================5). 数据表示为平均+/-SEM
图4
图4
Q175大脑中与ATG14相关的Vps34活性降低。一Q175大脑中的ATG14磷酸化。使用抗ATG14抗体对ATG14进行免疫纯化。每个实验显示两条具有代表性的车道。bATG14磷酸化的定量**第页 < 0.01 (n个===========================================================================5). 数据表示为平均+/-SEM。c（c）用Q175小鼠大脑中抗ATG14抗体拉下Vps34复合物的体外脂质激酶分析。采用薄层色谱法分离32P-PI（3）P。d日PI（3）P水平的量化标准化为IP中的Vps34水平***第页 < 0.001 (n个===========================================================================4). 数据表示为平均+/-SEM。e（电子）Q175小鼠的Beclin 1 S14磷酸化。（f）Beclin 1磷酸化的定量**第页 < 0.01 (n个===========================================================================5). 数据表示为平均+/-SEM。克表达mCFP-103Q的HeLa细胞中ATG14磷酸化。去除多西环素7天以诱导蛋白表达。对ATG14进行IP治疗。小时ATG14磷酸化定量。将数值标准化以进行控制*第页 < 0.05 (n个===========================================================================4). 数据表示为平均+/-SEM。我自噬体报告基因GFP-LC3在Q175纹状体核内分布的免疫荧光成像；GFP-LC3和控制WT；GFP-LC3小鼠。对6个月龄、10个月龄和15个月龄的小鼠进行检查。mHtt核聚集体染色为红色，GFP-LC3为绿色。比例尺10μm
图5
图5
蛋白质毒性应激导致ATG14磷酸化降低，ULK1重新分布到不溶性部分。一蛋白酶体抑制后ATG14磷酸化。p62的磷酸化位于S409。用MG132处理MEF细胞16 h，然后将其分离为Triton X-100可溶和不可溶部分。bATG14磷酸化定量***第页 < 0.001 (n个===========================================================================3). 数据表示为平均+/-SEM。c（c）ULK1积聚在Q175小鼠大脑中的Triton X-100不溶性部分。d日不溶性部分中ULK1的定量*第页 < 0.05 (n个===========================================================================3). 数据表示为平均+/-SEM。e（电子）蛋白酶体抑制后ATG14磷酸化。用MG132处理P62 WT或KO MEF细胞16 h，然后将其分离为Triton X-100可溶和不可溶部分。（f）可溶部分中ATG14磷酸化的定量。进行双向方差分析。MG132 F（1，8）的主要作用===========================================================================92.60，第页 < 0.0001；p62 KO F的主要作用（1,8）===========================================================================0.56,第页===========================================================================0.4748；相互作用F（1,8）===========================================================================7.82,第页===========================================================================0.0233. (n个===========================================================================3). 数据表示为平均+/-SEM。克不溶性部分中ULK1的定量。MG132 F（1，8）的主要作用===========================================================================252.94,第页 < 0.0001；p62 KO F的主要作用（1,8）===========================================================================87.94,第页 < 0.0001；交互作用F（1，8）===========================================================================81.33,第页 < 0.0001 (n个===========================================================================3). 数据表示为平均+/-SEM
图6
图6
ULK1活性调节polyQ蛋白的降解。一FLAG-ATG14 S29 WT、SA或SE、Beclin 1-AsRed和双myc-Vps34 his-Vps15质粒在表达mCFP-65Q的HeLa细胞中过度表达，然后用雷帕霉素处理过夜。细胞裂解物分为可溶性和不溶性组分。在不溶部分中测量PolyQ。b不溶性部分中polyQ降解的定量。降解率计算为对照样品与雷帕霉素样品的比率**第页 < 0.01 (n个===========================================================================4). 数据表示为平均+/-SEM。c（c）Myc空载体、Myc-ULK1 WT或KI在表达mCFP-65Q的HeLa细胞中过度表达，转染48小时后细胞被裂解。细胞裂解物分为可溶性和不溶性组分。在不溶部分中测量PolyQ。d日不溶性部分中polyQ水平的量化。将值归一化为空向量条件*第页 < 0.05 n.s.不显著(n个===========================================================================4). 数据表示为平均+/-SEM
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