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.2017年1月；23(1):38-49.
doi:10.1089/ten。TEC2016.0299年。

内皮细胞与平滑肌细胞相互作用的三维共培养模型分析

Minu Karthika Ganesan公司 1, 理查德·芬斯特瓦尔德 1, 海德·勒布 1, Ulrike Resch公司 2, 卡林·纽穆勒 1, 雷纳尔·德·马丁 2, 彼得·佩泽尔鲍尔 1
附属公司

内皮细胞与平滑肌细胞相互作用的三维共培养模型分析

Minu Karthika Ganesan公司等。 组织工程C部分方法. 2017年1月.

摘要

血管对生理和病理刺激的反应部分取决于管腔侧内皮细胞（EC）与构建血管壁内部的平滑肌细胞（SMC）之间的串扰。因此，血管病理生理的体外分析需要EC和SMC的共培养系统。我们已经开发并验证了一种改良的EC和SMC三维三明治共培养（3D-SW-CC），使用开放式μ-载玻片和薄玻璃底部，允许直接成像。培养皿包括一个中间板，以最小化半月板，从而使细胞分布均匀。将人脐动脉SMC夹在鼠尾胶原I涂层之间。在SMC静止后，将人脐带静脉EC接种在SMC顶部并培养至汇合处。到第7天，EC已形成融合的单层和连续的血管内皮（VE）-钙粘蛋白阳性细胞/细胞接触。下图，与第1天相比，纺锤形SMC已形成平行束，并显示出钙调素表达增加。EC和SMC之间是由层粘连蛋白、IV型胶原和珍珠糖组成的基质。3D SW-CC的E-selectin、angiopoietin-1、calponin和细胞间黏附分子1（ICAM-1）的基础信使RNA（mRNA）表达水平与新分离的小鼠下腔静脉相当。在3D SW-CC诱导的E-选择素和ICAM-1 mRNA和蛋白诱导中添加肿瘤坏死因子α（TNFα），与EC和SMC单层相当。相反，与EC和SMC单层相比，添加活化血小板诱导3D SW-CC显著延迟但更显著的活化。因此，该3D SW-CC允许分析EC和SMC之间的串扰，这些串扰调节细胞静止以及对复杂激活信号的响应。

关键词：三维模型；共培养；相声；内皮细胞；细胞外基质；血小板；平滑肌细胞。

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数字

<b>图1</b>
图1。
3D SW-CC的实验装置。（A）第1天，伊比迪μ-幻灯片4井的表面博士+涂有鼠尾胶原蛋白I。然后，105SMC/厘米2将SMC培养基接种到每个孔中，使其粘附，覆盖第二层I型胶原，并在SMC培养液中培养48 37°C时为h。然后，用无血清静止培养基代替生长培养基。（B）第4天，24天后 血清饥饿h，SMC获得收缩表型。（C）第5天，1.5 × 105将生长培养基中的EC接种在顶部SMC-胶原蛋白I三明治，孵育48小时 37°C时为h。（D）第7天，EC生长培养基替换为含有3.3%FCS的共培养基。3D SW-CC现在可以培养2周。3D SW-CC，三维三明治共培养；内皮细胞；FCS，胎牛血清；平滑肌细胞。
<b>图2</b>
图2。
第1天和第7天之间的3D SW-CC。（A）相位对比图像，第1天（D1）：分泌性SMC，第4天（D4）：收缩性SMC（D5）：添加EC顶部SMC和第7天（D7）：EC单层顶部收缩SMC，比例尺 = 200 微米。（B）Western blot分析所示天数的细胞周期蛋白D1、钙粘蛋白1和VE-cadherin蛋白表达。β-actin作为负荷控制。带强度归一化为β-肌动蛋白。条形图显示平均值 ± 标准偏差。n个 = 4中*第页 < 0.05，Tukey多重比较的单向方差分析事后（post-hoc）测试。方差分析；SD，标准偏差；VE，血管内皮。
<b>图3</b>
图3。
第7天对3D SW-CC进行三维重建。（A）三维SW-CC的共焦三维重建显示了两个分离的细胞层。播种前，用细胞跟踪器将SMC染成红色™橙色和EC用细胞追踪绿色染色。（B）正交切割Z堆栈图库，显示位于SMC（加载细胞跟踪器橙色）顶部的EC（加载细胞追踪器绿色）。（C）在距井底指定距离处，来自Z堆叠画廊的代表性共焦图像。固定3D SW-CC并对其进行α-平滑肌肌动蛋白染色(红色)用于SMC和VE-cadherin(绿色)对于EC，比例尺 = 50 微米。（D）Z堆栈库的三维重建。左侧图像：侧视图，正确的图像：前视图。固定3D SW-CC并对其进行α-平滑肌肌动蛋白染色(红色)用于SMC和VE-cadherin(绿色)对于EC，比例尺 = 50 微米。
<b>图4</b>
图4。
第7天3D SW-CC的血管基底膜。在距离井底指定距离处的Z堆叠廊道中的典型共焦图像以及相应的正交切割。固定3D SW-CC并染色以检测α-平滑肌肌动蛋白(红色、SMC）、VE卡德林(绿色、EC）、DAPI(蓝色，细胞核），以及指示的基质蛋白[白色,（A）胶原IV，（B）层粘连蛋白（C）珍珠糖]。比例尺 = 50 微米。DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。
<b>图5：</b>
图5：。
3D SW-CC的基本激活在第7天。通过实时定量PCR测定所示培养物中血管生成素1、钙调素1、E-选择素和ICAM-1的mRNA表达。将数据归一化为新分离的小鼠IVC的相应值。条形图显示平均值 ± 标准偏差。n个 = 4, *第页 < 0.05，用Dunnett的多重比较检验进行单因素方差分析。平均ΔC类T型每个样本组都包含值。下腔静脉导管，下腔静脉腔静脉；mRNA、信使RNA；聚合酶链反应。
<b>图6</b>
图6。
TNF刺激3D SW-CC。用10 0、1、6和24的肿瘤坏死因子α（ng/mL） h.裂解和mRNA分离后，E-选择素（A）和ICAM-1（C）用实时定量PCR检测mRNA表达。将数值标准化为相应的非模拟条件（0 h） ●●●●。条形图显示平均值 ± 标准偏差。n个 = 4, *第页 < 0.05，使用Bonferroni进行双向方差分析事后（post-hoc）测试。免疫荧光图像显示E-选择素（B）和ICAM-1（D）4岁和18岁后的蛋白质表达 分别刺激TNFαh。α-平滑肌肌动蛋白(红色)、VE-卡德林(绿色)，细胞核(蓝色)和E-selectin或ICAM-1(白色). 显示了代表性的共焦图像（20 × 放大），比例尺 = 50 微米。TNF、肿瘤坏死因子。
<b>图7</b>
图7。
用活化血小板刺激3D SW-CC。所示距离井底指定距离处Z堆叠廊道中3D SW-CC的典型共焦图像，以及（A）在第7天控制3D SW-CC，（B）与血小板共培养24小时后的3D SW-CC（比例为100:1） h.固定后，对细胞进行α-SMA染色(红色)、VE-卡德林(绿色)血小板的CD41(白色). 比例尺 = 50 微米。（C）在添加血小板后的指定时间点，对细胞进行裂解，分离mRNA，并通过实时定量PCR测定所示培养物中E-selectin和ICAM-1的表达。将表达水平标准化为相应的未刺激条件（0 h） ●●●●。条形图显示平均值 ± 标准偏差。n个 = 4,*第页 < 0.05，使用Bonferroni进行双向方差分析事后（post-hoc）测试。
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