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.2017年5月；28(5):1475-1490.
doi:10.1681/ASN.2016070709。 Epub 2016年12月5日。

法国试验标准κB诱导的骨膜炎激活整合素-β3促肾小球肾炎肾损伤的信号转导

尼基·普拉库拉 1, 卡夫瓦达斯帕纳焦蒂斯 1, 拉斐尔·科尔曼 1 2, 让-克洛德·杜索 1 2 三, 克里斯托斯·查迪克里斯托斯 1 2, 克里斯托斯·查齐安托尼奥 4 2
附属公司

法国试验标准κB诱导的骨膜炎激活整合素-β3促肾小球肾炎肾损伤的信号转导

尼基·普拉库拉等。 J Am Soc肾病. 2017年5月.

摘要

从头开始骨膜抑素（一种参与牙本质形成和骨形成的蛋白）在肾脏的表达被认为是肾脏疾病的生物标志物。在这项研究中，我们研究了诱导机制和骨膜炎在肾脏疾病中的作用。结合生物信息学、报告分析和染色质免疫沉淀分析，我们发现NFκB和其他促炎转录因子诱导骨膜蛋白表达在体外实验性肾小球肾炎期间，肾小球中这些因子与骨膜炎素启动子的结合丰富。缺乏骨膜炎素表达的小鼠在肾小球肾癌期间表现出保留的肾功能和结构。此外，对患有肾小球肾炎的野生型动物延迟给予骨膜抑素反义寡核苷酸可以逆转已经形成的蛋白尿，减轻组织炎症，改善肾脏结构。骨膜炎蛋白表达的缺乏也减弱了从头开始整合素在肾脏的表达-β3和粘着斑激酶和AKT的磷酸化，已知的整合素介质-β3在野生型动物GN期间观察到的影响细胞运动和存活的信号。体外重组骨膜素增加了整合素的表达-β3和足细胞中黏着斑激酶和AKT的伴随磷酸化。值得注意的是，骨膜蛋白和整合素-β3在炎症性肾炎患者的活检标本中高度共定位。这些结果表明，骨膜蛋白和肾脏炎症之间的相互作用协调了炎症和纤维化反应，通过下游整合素的激活驱动足细胞损伤-β3信号。以骨膜炎为靶点可能是治疗CKD的一种新的治疗策略。

关键词：肾脏疾病的病理生理学及其进展；细胞-基质相互作用；肾小球肾炎；巨噬细胞；转录调控。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
在NTS诱导的GN模型中，骨膜炎素被促炎性转录因子上调。（A）生物信息学分析结果显示，小鼠骨膜炎素启动子方案具有假定的转录因子结合位点。（B–D）荧光素酶在HEK293细胞中的表达结果表明，人和小鼠骨膜蛋白启动子活性均由p65（NF）高度诱导κβ亚单位（B），并在较小程度上受到其他促炎转录因子如c-Jun、STAT1和STAT6（c），或纤维化前转录因子如Smad3、Smad4和Smad5（D）的影响。（E） 用指示的转录因子转染到与荧光素酶检测结果（F-I）相当的水平后，HEK293细胞中内源性骨膜蛋白mRNA的表达被诱导。在NTS诱导的GN模型中进行的ChIP分析显示，促炎转录因子p65（F）、p-c-Jun（G）和p-STAT1（H）在periostin启动子的几个位置上高度富集体内NTS之后。相反，p-Smad3是一种纤维化前转录因子，在NTS（I）后，它并没有在骨膜蛋白启动子上富集。对于老鼠，n个=每组4人。对于细胞培养物，显示了三组进行的三个独立实验的定量*P（P）<0.05; **P（P）与对照或野生型PBS相比<0.01。
图2。
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Periostin KO小鼠可免受NTS诱导的GN的发展。（A和B）Periostin mRNA（A）和蛋白质（B）在NTS诱导GN中增加。（C和D）Periossin KO鼠可高度保护其免受NTS引起的体重增加（C）和蛋白尿（D）的影响。（E） Masson三色染色显示骨膜蛋白KO小鼠的纤维化和组织损伤减轻（上面板，×200；下面板，×400）。（F） 肾小球病变的量化。纤维化分子COL1（G）、COL3（H）和TGF的（G-I）mRNA表达-βNTS后骨膜蛋白KO小鼠的1（I）高度降低。NTS后骨膜炎KO小鼠炎症介质MCP-1（J）、RANTES（K）和VCAM-1（L）的（J–L）mRNA表达减少。（M和N）F4/80（M）和CD3（N）染色显示NTS后骨膜炎KO小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的蓄积量分别显著减少。染色的量化如下图所示。显示了整个肾脏的mRNA和蛋白质结果（A、B、G–L）。给药14天后，对动物实施安乐死。比例尺，100μm（E、m和N）。n个=每组6-7人*P（P）<0.05; **P（P）与WT PBS或WT NTS相比<0.01；#P（P）与WT NTS相比<0.05。WT，野生型。
图2。
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Periostin KO小鼠可免受NTS诱导的GN的发展。（A和B）Periostin mRNA（A）和蛋白质（B）在NTS诱导GN中增加。（C和D）Periossin KO鼠可高度保护其免受NTS引起的体重增加（C）和蛋白尿（D）的影响。（E） Masson三色染色显示骨膜蛋白KO小鼠的纤维化和组织损伤减轻（上面板，×200；下面板，×400）。（F） 肾小球病变的量化。纤维化分子COL1（G）、COL3（H）和TGF的（G-I）mRNA表达-βNTS后骨膜蛋白KO小鼠的1（I）高度降低。NTS后骨膜炎KO小鼠炎症介质MCP-1（J）、RANTES（K）和VCAM-1（L）的（J–L）mRNA表达减少。（M和N）F4/80（M）和CD3（N）染色显示NTS后骨膜炎KO小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的蓄积量分别显著减少。染色的量化如下图所示。显示了整个肾脏的mRNA和蛋白质结果（A、B、G–L）。给药14天后，对动物实施安乐死。比例尺，100μm（E、m和N）。n个=每组6-7人*P（P）<0.05; **P（P）与WT PBS或WT NTS相比<0.01；#P（P）与WT NTS相比<0.05。WT，野生型。
图3。
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用反义骨膜蛋白延迟治疗可逆转NTS诱导的GN的发展。（A和B）在NTS扰乱小鼠中，骨膜蛋白mRNA（A）和蛋白（B）增加，但在用反义ODN治疗的小鼠中降低。（C–E）NTS后在D3启动反义处理逆转了NTS打乱小鼠体重（C）、蛋白尿（D）和BUN（E）的增加。（F） Masson三色染色显示NTS反义处理小鼠的纤维化和组织损伤减少（上图，×200；下图，×400）。（G和H）在NTS反义处理的小鼠中，结构肾小球（G）和肾小管（H）改变的定量显示新月形形成、纤维蛋白沉积、肾小球硬化和肾小管扩张高度减少。纤维化分子COL1（I）、COL3（J）和TGF的（I–K）mRNA表达-βNTS后，反义处理小鼠的1（K）减弱。NTS后反义处理小鼠炎症介质MCP-1（L）、VCAM-1（M）和CSF-1（N）的（L-N）mRNA表达降低。（O和P）F4/80（O）和CD3（P）染色显示，经骨膜抑素反义处理的NTS小鼠的巨噬细胞和淋巴细胞分别显著减少。染色的量化如右图所示。给药9天后，对动物实施安乐死。比例尺，100μm（F、O和P）。n个=每组5人*P（P）<0.05; **P（P）与PBS相比<0.01；#P（P）<0.05;##P（P）<0.01与NTS加扰。
图3。
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用反义骨膜蛋白延迟治疗可逆转NTS诱导的GN的发展。（A和B）在NTS扰乱小鼠中，骨膜蛋白mRNA（A）和蛋白（B）增加，但在用反义ODN治疗的小鼠中降低。（C–E）NTS后在D3启动反义处理逆转了NTS打乱小鼠体重（C）、蛋白尿（D）和BUN（E）的增加。（F） Masson三色染色显示NTS反义处理小鼠的纤维化和组织损伤减少（上面板，×200；下面板，×400）。（G和H）NTS反义处理小鼠的结构肾小球（G）和肾小管（H）变化的量化显示新月体形成、纤维蛋白沉积、肾小球硬化和肾小管扩张高度减少。纤维化分子COL1（I）、COL3（J）和TGF的（I–K）mRNA表达-βNTS后，反义处理小鼠的1（K）减弱。NTS后反义处理小鼠炎症介质MCP-1（L）、VCAM-1（M）和CSF-1（N）的（L-N）mRNA表达降低。（O和P）F4/80（O）和CD3（P）染色显示，经骨膜抑素反义处理的NTS小鼠的巨噬细胞和淋巴细胞分别显著减少。染色的量化如右图所示。给药9天后，对动物实施安乐死。比例尺，100μm（F、O和P）。n个=每组5人*P（P）<0.05; **P（P）与PBS相比<0.01；#P（P）<0.05;##P（P）<0.01与NTS加扰。
图4。
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Periostin和整合素-β在NTS诱导的肾小球肾炎模型中，3定位于损伤部位。（A和D）WT/KO（A）和打乱/反义（D）小鼠的骨膜炎素免疫组织化学染色显示，WT-NTS小鼠肾小球和血管中骨膜炎素的表达增加，KO中没有骨膜炎素表达，反义小鼠中有所改善。（B和E）整合素-β3 mRNA表达在WT-NTS（B）和NTS加扰（E）小鼠中诱导，但在KO-NTS和NTS反义小鼠中分别显著改善。整合素的（C和F）免疫组织化学定位-β3在WT/KO（C）和扰乱/反义（F）小鼠中分别显示在WT NTS小鼠的肾小球和血管中的表达增加，而在KO和反义小鼠中其表达高度减弱。（G） 整合素的免疫组织化学染色-βWT-NTS小鼠连续切片中的3和骨膜蛋白，显示这两种蛋白在相同位置的定位（箭头表示这两种蛋白质在相同结构中的表达）。（H） 骨膜蛋白（绿色）/巢蛋白（红色）和整合素的双重免疫荧光-βWT NTS小鼠中的3（绿色）/nestin（红色），表明骨膜炎素和整合素-β3在NTS小鼠肾小球中由足细胞表达。（一） 骨膜抑素或整合素的双重免疫荧光-βWT NTS小鼠中的3（绿色）和CD44（红色）表明，这两种蛋白均由活化的壁上皮细胞强烈表达。骨膜炎（绿色）的双重免疫荧光α-SMA或CD146（红色）分别与系膜细胞和内皮细胞无共定位。（J） 抗整合素协同免疫沉淀分析-β3抗体成功沉淀两种整合素-β3和骨膜蛋白，表明这两种蛋白质相互作用体内在NTS模型中。样品在相同的凝胶上运行，但不连续。在分别使用KO（A-C）或反义（D-J）进行的一系列实验中，在NTS 14或9天后对动物实施安乐死。比例尺，100μm（G）或50μm（A、C、D、F、H和I）。显示了具有代表性的图像。n个=每组5-7人*P（P）与WT PBS相比<0.05；#P（P）<0.05与WT NTS或NTS加扰。
图4。
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骨膜炎素和整合素-β在NTS诱导的肾小球肾炎模型中，3定位于损伤部位。（A和D）WT/KO（A）和打乱/反义（D）小鼠的骨膜炎素免疫组织化学染色显示，WT-NTS小鼠肾小球和血管中骨膜炎素的表达增加，KO中没有骨膜炎素表达，反义小鼠中有所改善。（B和E）整合素-β3 mRNA表达在WT-NTS（B）和NTS加扰（E）小鼠中诱导，但在KO-NTS和NTS反义小鼠中分别显著改善。整合素的（C和F）免疫组织化学定位-β3在WT/KO（C）和打乱/反义（F）小鼠中，WT-NTS小鼠肾小球和血管中的表达增加，在KO和反义小鼠中分别高度减弱。（G） 整合素的免疫组织化学染色-βWT-NTS小鼠连续切片中的3和骨膜蛋白，显示这两种蛋白在相同位置的定位（箭头表示这两种蛋白质在相同结构中的表达）。（H） 骨膜蛋白（绿色）/巢蛋白（红色）和整合素的双重免疫荧光-β野生型NTS小鼠中的3（绿色）/nestin（红色），显示骨膜素和整合素-β3在NTS小鼠肾小球中由足细胞表达。（一） 骨膜抑素或整合素的双重免疫荧光-βWT NTS小鼠中的3（绿色）和CD44（红色）表明，这两种蛋白均由活化的壁上皮细胞强烈表达。骨膜炎（绿色）的双重免疫荧光α-SMA或CD146（红色）分别未显示与系膜细胞和内皮细胞共定位。（J） 使用抗整合素的共免疫沉淀分析-β3抗体成功沉淀两种整合素-β3和骨膜蛋白，表明这两种蛋白质相互作用体内在NTS模型中。样品在相同的凝胶上运行，但不连续。在分别使用KO（A-C）或反义（D-J）进行的一系列实验中，在NTS 14或9天后对动物实施安乐死。比例尺，100μm（G）或50μm（A、C、D、F、H和I）。显示了具有代表性的图像。n个=每组5-7人*P（P）与WT PBS相比<0.05；#P（P）<0.05与WT NTS或NTS加扰。
图5。
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骨膜炎素促进整合素-β3信号体内和在体外Western blot显示WT/KO NTS小鼠中pFAK的表达。在野生型小鼠中观察到NTS后FAK磷酸化的增加在KO小鼠中减弱。（B） pAKT免疫组织化学染色显示NTS后WT小鼠肾小球和血管上调，KO小鼠上调。（C） p-FAK和p-AKT（绿色）与CD44或nestin（红色）的双重免疫荧光显示，这两种蛋白均由NTS小鼠肾小球中活化的壁上皮细胞和足细胞表达。（D） E11永生化足细胞与重组小鼠骨膜蛋白（400 ng/ml）孵育指定时间点，并对整合素进行Western blot分析-β3、pFAK、pAKT和GAPDH，量化图显示在右侧。骨膜炎孵育6小时时整合素-β3及其下游效应器pFAK和pAKT上调。（E） E11细胞在增加重组小鼠骨膜蛋白（400和1000 ng/ml）剂量的情况下培养6小时，然后进行整合素的Western blot分析-β3、pFAK、FAK、pAKT、AKT和GAPDH。数量显示在右侧。随着骨膜炎剂量的增加，pFAK和pAKT在孵育后保持升高。比例尺，100μm（B和C）。n个=每组6-7只小鼠。给药14天后，对动物实施安乐死。对于细胞培养，显示了三次独立实验的数量*P（P）与对照组相比<0.05**P（P）与WT PBS或对照组相比<0.01。
图6。
图6。
Periostin和整合素-β3种在人类肾活检中共存。（A） 整合素的免疫组织化学染色-βANCA血管炎患者活检标本的连续切片中显示骨膜炎蛋白和整合素的强表达和高度共定位-β3在受损的肾小球和肾小管中。（B） （A）中绘制的面板放大图像，更详细地显示了骨膜炎素和整合素的共表达-β3例发生于受损的肾小球和周围小管。箭头表示同位化位点。比例尺，100μm（A）或30μ米（B）。显示了具有代表性的图像。
图7。
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骨膜炎如何介导肾损伤的拟议机制。促炎性转录因子，主要因子为NFκβ，诱导骨膜炎素的表达，激活整合素-β诱导整合素下游信号传导，导致细胞运动、存活和足细胞足突消失。同时，骨膜炎素促进几种趋化因子（MCP-1、RANTES、VCAM-1和CSF-1）和纤维化前分子（COL1、COL3和TGF）的组织表达-β1） 诱导炎症细胞浸润和基质稳定，足细胞损伤进一步放大这些效应，导致恶性循环。
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