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.2017年1月1日；144(1):115-127.
doi:10.1242/dev.143131。 Epub 2016年12月2日。

壁细胞和内皮细胞之间的相互作用稳定斑马鱼背主动脉的发育

琥珀N斯特拉曼 1, 索非亚A Pezoa 1, 奥利维亚·M·法雷利 1, 丹尼尔·卡斯特拉诺娃 1, Louis E Dye第三 2, 马修·巴特勒 1, 哈文·西迪克 三, 威廉·S·塔尔博特 三, 布兰特·M·温斯坦 4
附属公司

壁细胞和内皮细胞之间的相互作用稳定斑马鱼背主动脉的发育

琥珀N斯特拉曼等。 开发. .

摘要

壁细胞（血管平滑肌细胞和周细胞）在血管系统的发育中发挥着重要作用，通过与内皮细胞的相互作用促进血管静止和长期血管稳定。然而，关于壁细胞如何稳定血管的机制细节还不完全清楚。我们已经使用斑马鱼研究了在早期发育过程中植入背主动脉的壁细胞的出现和功能作用。与之前的文献一致，我们的数据表明，包裹背主动脉的细胞来自邻近硬结组织中的亚群细胞。通过阻断pdgfr信号抑制壁细胞向背主动脉募集导致血管基底膜减少，进而导致背主动脉血管弹性增强，无法限制主动脉直径。我们的研究结果提供了直接的体内证据，证明壁细胞通过产生和维持血管基底膜来防止主动脉异常扩张和弹性，在早期血管系统的模式化和稳定中发挥功能作用。

关键词：PDGFR信号；周细胞；血管基底膜；血管平滑肌；斑马鱼。

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作者声明没有竞争或财务利益。

数字

图1。
图1。
血管平滑肌细胞与斑马鱼背主动脉相关。（A） 2的清晰摄影机绘图 dpf斑马鱼胚胎（Kimmel等人，1995），放大后的红框区域如B所示，蓝框区域如C-F所示 受精后第天。主干循环流经背主动脉（DA）、后主静脉（PCV）、节段间动脉（ISA）和节段间静脉（ISV）。血管显示为相对于中干邻近组织和结构的血管，包括肠道（G）、脊索（N）、神经管（NT）、左前肾管（P）、皮肌节（D）、肌节（M）和硬结节（S）。（C-F）背主动脉的典型共焦图像Tg（tagln:egfp），Tg（kdrl:mCherryCAAX）双转基因斑马鱼 dpf（C），3 dpf（D），5 dpf（E）或7 dpf（F），带有红色荧光血管内皮细胞和绿色荧光vSMCs，显示vSMC在背主动脉上积聚。（G） 背主动脉1-7节段前6体节vSMC积聚的定量 dpf。数值为平均值±标准误差。；n个=5条鱼。（H-J）电子显微镜证实DA对血管平滑肌细胞的投资。主动脉背壁3的典型图像 dpf（H），7 dpf（I）和14 dpf（J）如图所示。EC和vSMC分别是伪彩色的红色和绿色。B组改编自Isogai等人（2003年）。比例尺：50 微米（C-F）。
图2。
图2。
主干vSMC的起源。（A，B）图解说明从硬化节（A）或躯干神经嵴（B）招募到背主动脉的vSMC起源和迁移的两种替代模型的示意图。（C-H）1的树干横截面 dpf（C-E）或3 dpf（F-H）全山动物就地杂交表达分析，用标记2（C，F），pdgfrb型（D，G）或扭转1a（东、西）。这三个标记在1处的硬化节中表达更广 dpf（C-E），但增加了3 dpf的表达仅限于DA的SMC（红色箭头）和肠道（F，G）或DA单独（H）。（一） 3.5中躯干的共焦侧视图 数字功率因数Tg（tagln:gfp），Tg（sox10:rfp）双转基因动物。背主动脉缺乏RFP表达提示塔根+vSMC不是神经嵴起源。DA，背主动脉。（J） 的示意图Tg（Ola-twist:gal4）和Tg（uas:kaede）转基因。在Tg（Ola-twist:gal4）,Tg（uas:kaede）双转基因鱼(野生稻）捻度启动子（Ola-twist）用于从Ola-twist:gal4扭转转基因，然后激活绿色到红色光转换kaede的表达uas：凯德转基因。（K） 4例背主动脉共焦侧视图 数字功率因数Tg（Ola-twist:gal4），Tg（uas:kaede）， Tg（标签：nlsGFP-2a-CFP-F）三重转基因动物，在4dpf的条件下，将核表达的kaede光转换为红色荧光以标记扭转1-阳性细胞。无数双正塔根+（绿核），扭转+（红色细胞质）细胞在背主动脉（箭头）上清晰可见。在两轮光转换实验中，共拍摄了五条鱼的图像，结果相当。（五十） 的示意图Tg（标签：nlsgfp-2a-cfp-f）转基因，带有塔根启动子驱动核定位GFP和膜定位法尼基CFP的表达，由2A肽连接子连接。（M） 从从Tg（tagln:nlsgfp-2a-cfp-f），Tg（kdrl:mCherryCAAX）双转基因鱼显示了塔根+核（黄色）从邻近的硬膜瘤到背主动脉（用虚线标出）。图像重建显示的是腹部视图，从嘴侧到顶部。每10次采集共焦图像 分钟，显示的静止图像约为50 最小间隔。总共七个塔根+在五个不同的延时实验中，DA周围的细胞核被追踪到硬化器。比例尺：50 微米。
图3。
图3。
抑制脉冲多普勒频率信号传导导致背主动脉壁细胞覆盖丧失。（A） 示意图显示温度（HSP70:gal4和无人机系统：pdgfrbDN YFP）双转基因用于热休克诱导表达pdgfrbDN.这些鱼被杂交到Tg（标签：egfp）转基因鱼产生三重杂合子，每天在指定的时间范围内进行热休克，并在6日对壁壁细胞覆盖率进行成像分析 dpf。（B-I）6幅典型共焦图像 dpf热冲击Tg（tagln:egfp），Tg（HSP70:gal4）控件（Ctrl、B、D、F、H）或Tg（标签：egfp）， Tg（HSP70:gal4），Tg（UAS:pdgfrbDN-YFP）显性阴性-显示了表达（DN，C，E，G，I）的动物。鱼类从1-6日开始每天受到热休克 dpf（B-E），2-6 dpf（F-G）或3-6 dpf（H-I），然后在6时成像 dpf。这个标签/sm22+与背主动脉相关的vSMC以绿色显示；显示血管室的红细胞自体荧光为红色。（J）量化指示热休克间隔后覆盖背主动脉的vSMC数量。Tg（标签：egfp）， Tg（HSP70:gal4），Tg（UAS:pdgfrbDN-YFP）热冲击诱导显性负PDGFRB（DN）或Tg（标签：egfp）， Tg（热休克蛋白70:gal4）对照组（Ctrl）鱼类受到热休克，如图所示，图片显示为6 dpf和数量标签/sm22+计算背主动脉每3体节长度的细胞数。将值标准化为标签/sm22+非热休克DN鱼的细胞计数。数值为平均值±标准误差*P（P）与非热休克DN鱼相比，显著性≤0.05。数据来自以下单个实验n个=5条鱼；2、3、4的两个实验重复 第1-6天的HS实验和四个实验重复 进行第HS天的验证，结果一致。在更绝对的值中，我们通常会看到大约20个vSMC在控制条件下向背主动脉的3体节段募集，而～7-8个vSMCs在DN激活条件下向3体节长的背主动脉募集。比例尺：1 mm（B、C）和50 微米（D-I）。
图4。
图4。
壁细胞调节主动脉的直径和弹性。（A） 斑马鱼血管发育期间，背主动脉上vSMCs的积累与背主动脉直径随时间的减少呈负相关。背主动脉直径标准化为起始值48 hpf值和vSMC数归一化为最终80 hpf值。n个=3条鱼。（B、C）代表2 dpf（B）和3.25 背主动脉共焦图像的dpf（C）横向重建Tg（kdrl:mCherryCAAX）转基因斑马鱼，放大倍数相同。（D，E）壁细胞覆盖范围的丧失导致斑马鱼背主动脉扩张。代表5 中躯干背主动脉的dpf共焦图像Tg（kdrl:mCherryCAAX），Tg（tagln:egfp）， Tg（热休克蛋白70:gal4）控制（D）或Tg（kdrl:mCherryCAAX），Tg（tagln:egfp）， Tg（HSP70:gal4），Tg（UAS:pdgfrbDN-YFP）显性阴性pdgfrbDN热休克1-5次的转基因表达（E）胚胎 白天课程。（F） 定量背主动脉直径，显示热休克时背主动脉明显扩张pdgfrbDN与非热休克或热休克对照兄弟姐妹进行比较。未发现对主静脉直径的影响。每个样本至少测量三条鱼，每条鱼有十次单独的背主动脉测量。实验重复三次，结果一致；N.S.，不显著。（G） vSMC覆盖的丧失导致发育中的斑马鱼胚胎背主动脉的弹性增加。热冲击控制（保持vSMC覆盖范围）与热冲击pdgfrbDN（显示vSMC覆盖范围明显丧失）使用SPIM对鱼类进行成像。以每秒22帧的速度采集图像，以捕捉背主动脉壁随动物心跳而膨胀和收缩时的运动（“弹性”）。数据以直径变化百分比[（主动脉最大宽度-主动脉最小宽度）/主动脉最小宽度×100]报告。每个样品测量五条鱼，每条鱼测量三个单独的背主动脉。平均值±标准偏差（H-J）壁细胞对EC管径的调节可在三维胶原基质分析中建模在体外。显示了EC-only培养（H）和EC-pericyte共培养（I）的代表性图像。（J） 在三维胶原基质中建立的内皮细胞培养物和内皮细胞-脂肪细胞共培养物中内皮管直径的量化，显示存在壁细胞（周细胞）时，内皮细胞管直径显著减小。n个=5张来自不同胶原蛋白塞的图像，每张图像10个测量值。比例尺：50 微米。数值为平均值±标准差。
图5。
图5。
细胞间的相互作用促进血管基底膜的沉积和维持。（A-C）壁细胞促进血管基底膜沉积在体外（A）使用无洗涤剂免疫染色方案，在单独使用内皮细胞（黑色）或内皮细胞-脂肪细胞共培养（灰色）的三维胶原基质分析中，量化基底膜成分IV型胶原和纤维连接蛋白，以仅评估这些蛋白的细胞外沉积。仅EC（B）和EC-嗜酸细胞共培养（C）中IV型胶原染色的代表性图像；n个>5个单独的免疫染色胶原塞。（D-J）vSMC促进血管基底膜沉积和稳定性体内（D-I）5 dpf无热休克双转基因横切片中背主动脉IV型胶原（D，F，H）或纤维连接蛋白（E，G，I）免疫染色的代表性图像Tg（HSP70:gal4；UAS:pdgfrbDN-YFP）动物（D、E），1-5 dpf热冲击控制Tg（热休克蛋白70:gal4）动物（F、G）或1-5 dpf热冲击pdgfrbDN-表达双转基因Tg（HSP70:gal4；UAS:pdgfrbDN-YFP）动物（H，I）。（J） 5的量化 dpf背主动脉IV型胶原或纤维连接蛋白免疫染色强度，使用如D-I所示切片的相对基底膜染色强度。所有数据显示为无热休克控制条件的百分比。n个=共10条鱼，来自三个单独实验的综合数据。（K） western blot分析定量基底膜蛋白水平(n个＝3个印迹，来自三个单独的实验）。数据以无热冲击控制条件的百分比表示。（五十） 与微管蛋白负荷对照组相比，显示了典型的western blot图像。（M） 通过收集非还原条件下的蛋白裂解物，分析了壁细胞调节全长基底膜组件维持的能力。无热冲击控制，热冲击控制（不携带pdgfrbDN磁带）和pdgfrbDN收集热休克处理裂解产物，分析IV型胶原和层粘连蛋白的蛋白质断裂水平。显示了具有代表性的蛋白质印迹，仅在pdgfrbDN热休克条件下，壁画细胞覆盖被破坏。全长蛋白质的位置用星号标记。来自十个斑马鱼胚胎混合液和两个单独实验的裂解液的代表性蛋白质印迹。比例尺：50 微米。数值为平均值±标准误差。
图6。
图6。
血管基底膜在功能上调节主动脉的直径和稳定性。基底膜组件受损导致主动脉直径和弹性增加。（A，B）4例患者背主动脉（A）和后主静脉（B）直径的量化 数字功率因数列4a1吗啉注射或列4a1st93/st93突变动物与对照野生动物的比较。每个样品至少测量四条鱼，每条鱼测量十个单独的背主动脉。N.S.，不显著。（C-J）4张具有代表性的透射光（C，D）和共焦（E-J）图像 dpf控制（C、E、G、I），列4a1吗啉注射（D、F、H），或列4a1第93页突变体（J）动物，显示整个动物（C，D）躯干血管系统（E，F）的侧视图和背主动脉（G-J）的高倍侧视图。括号表示背主动脉的直径。4例患者背主动脉弹性的（K，L）量化 数字功率因数列4a1吗啉注射（K）或第4列1标准93使用SPIM将突变（L）动物与对照野生型动物进行比较。数据以直径变化百分比的形式报告。每个样本至少测量四条鱼，每条鱼分别测量三条背主动脉。比例尺：50 微米。数值为平均值±标准误差。
图7。
图7。
壁细胞通过基底膜的沉积调节血管的生长和稳定性。壁画细胞在血管稳定中所起作用的示意图。在对照条件下，壁细胞（绿色）从硬结组织剥离，与背主动脉（红色）相连。这些细胞与内皮细胞相互作用，促进基底膜蛋白沉积和维持（粉红色）。在抑制壁细胞募集的条件下（即。pdgfrbDN)血管稳定性明显受损，基底膜沉积减少。
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