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.2016年12月13日；113(50):14408-14413.
doi:10.1073/pnas.1618029113。 Epub 2016年11月29日。

发育中人脑中寨卡病毒的细胞嗜性及阿奇霉素的抑制作用

汉娜·雷塔拉克 1, 伊丽莎白·迪·卢洛 2 三, 卡罗来纳州阿里亚斯 1 4, 克里斯汀·克诺普 1, 马修·T·劳里 1, 卡门·桑多瓦尔-埃斯皮诺萨 2 三, 沃尔特·曼西亚·利昂 2 三, 罗伯特·克伦西克 5 6, 埃里克·穆利安 5, 朱利安·斯帕塔扎 2 7, 亚历克斯·A·花粉 2 三, 卡莱·曼德尔·布雷姆 1, 托马斯·诺瓦科夫斯基 2 三, 阿诺德·克里格斯坦 8 三, 约瑟夫·德里西 9
附属机构

发育中人脑中寨卡病毒的细胞嗜性及阿奇霉素的抑制作用

汉娜·雷塔拉克等。 美国国家科学院院刊. .

摘要

寨卡病毒（ZIKV）的迅速传播及其与大脑发育异常的关联构成了全球卫生紧急情况。先天性ZIKV感染会产生一系列轻微到严重的病变，包括小头畸形。为了了解ZIKV感染的病理生理学，我们使用了发育中的大脑模型，忠实地再现了妊娠早期至中期的组织结构。我们确定了主要人体组织中最易受ZIKV感染的脑细胞群体，为病毒进入机制提供了证据，并表明常用抗生素通过减少病毒增殖来保护培养的脑细胞。在大脑中，ZIKV优先感染神经干细胞、星形胶质细胞、少突胶质前体细胞和小胶质细胞，而神经元不易感染。这些发现表明，患有先天性ZIKV感染的婴儿出现小头畸形和其他病理特征的机制，这些病理特征不能仅用神经干细胞感染来解释，例如皮质板钙化。此外，我们发现阻断富含胶质细胞的假定病毒进入受体AXL可以减少体外星形胶质细胞的ZIKV感染，而胶质细胞系中AXL的基因敲除几乎可以消除感染。最后，我们评估了2177种化合物，重点是妊娠期安全药物。我们发现，大环内酯类抗生素阿奇霉素降低了胶质细胞系和人类星形胶质细胞中病毒的增殖和病毒诱导的细胞病变效应。我们对发育中人脑感染的描述阐明了先天性ZIKV感染的发病机制，并为研究可能的治疗策略提供了基础，以安全缓解或预防疫情的最严重后果。

关键词：寨卡病毒；阿奇霉素；皮层发育；小头畸形。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
ZIKV对发育中人脑放射状胶质细胞的趋化作用。用ZIKV-BR感染人皮层器官型脑片，培养72h(A类和B类)皮层内ENV（绿色）检测到的ZIKV感染的低放大率概述。(A类)ENV染色根据区域和细胞类型进行分析。CP，皮质板；OSVZ，室下外侧区；SP，底板；VZ，心室区。（比例尺，100μm）(B类)高倍放大A类值得注意的是，ENV染色（箭头）似乎优先富集在VZ和OSVZ中。（比例尺，20μM。）(C类)ENV量化+按区域划分的单元格(顶部)和单元格类型(底部)13至14%。n个= 2; 平均值±SD[SI材料和方法; 如果误差条短于线条厚度，则不会显示误差条(顶部、CP；底部，SOX2）]。(D类)在发育中的人类大脑中，在中脑神经发生期间观察到易受ZIKV感染（绿色）影响的细胞类型的示意图摘要。(E类)OSVZ中ZIKV感染的放射状胶质细胞的高倍放大图（箭头所示）。oRG，外放射状胶质细胞。（比例尺，10μm）(F类)三维重建E类，强调ENV信号在细胞内的存在。（比例尺，10μm）(G公司)OSVZ细胞中的ENV和NS5信号（箭头）表明复制了ZIKV-PR（比例尺，20μm）(H（H）)未成熟神经元（SATB2+，蓝色）感染了ZIKV（箭头）。（比例尺，20μm）(我)小胶质细胞（IBA1+)ENV免疫阳性。高放大倍数(赖特)显示ENV+具有变形虫形态的小胶质细胞（箭头所示），是典型的活化小胶质细胞。（比例尺，10μm）
图S1。
图S1。
细胞培养中ZIKV感染的特征。(A类)Vero和U87细胞在MOI为10时感染ZIKV。在感染后0、8、16、28、32和46小时收集上清液，并将其滴度到原始Vero细胞上。通过ENV蛋白染色细胞的定量成像计算每个时间点的病灶形成单位（FFU）数量。n个= 4; 平均值±SEM(B类)U87细胞和hPSC衍生的星形胶质细胞以1的MOI感染ZIKV-PR。在48 hpi时，对细胞进行ENV蛋白和细胞DNA（DAPI，蓝色）的免疫染色并成像。注意包膜信号的核排斥和核周堆积。（比例尺，100µm）(C类)U87细胞中ENV蛋白染色需要在染色过程中进行渗透。在48 hpi时，细胞被固定并渗透，或在ENV蛋白染色前未经处理。仅在透化条件下检测到阳性ENV蛋白染色，表明细胞内存在ENV蛋白。（比例尺，100μm）方框区域的高倍放大(赖特). (D类)用翻译抑制剂环己酰亚胺治疗可显著减少感染后U87细胞中ENV蛋白的染色。用放线菌酮处理U87细胞1小时，并在药物存在下以20的MOI感染ZIKV-PR。在48 hpi时，对细胞进行ENV蛋白染色并成像。（比例尺，100µm）
图S2。
图S2。
ZIKV的放射状胶质细胞向性在菌株之间是保守的。(A类)ZIKV-BR器官型切片培养感染概述。注意许多ENV的存在+心室区的细胞。（比例尺，100μm）(B类)VZ中的放射状胶质细胞感染，显示高密度的感染细胞簇（箭头所示）。（比例尺，100μm）(C类–F类)ZIKV-BR感染的心室桡侧胶质细胞高度放大的例子(C类和D类)、ZIKV-PR(E类)，或ZIKV-CAM(F类)显示SOX2+细胞核（白色箭头，C类--F类)和ENV+细胞体/过程（黄色箭头，C类和D类). （比例尺，10μm）(D类)感染细胞的三维重建C类.
图S3。
图S3。
ZIKV-PR感染后细胞凋亡轻微增加。(A类和B类)VZ公司(A类)和OSVZ(B类)感染后第3天（dpi）15.5 pcw，在ZIKV-PR感染的切片中显示ENV和裂解caspase-3染色(顶部)与模拟感染相比(底部). 合并图像显示ZIKV-PR感染的细胞和裂解的胱天蛋白酶-3阳性细胞之间缺乏重叠。（比例尺，100μm）(C类和D类)用ZIKV-PR以5 dpi的速度在17 pcw的切片上染色(C类,顶部)低倍放大显示DAPI、裂解的胱天蛋白酶-3和ENV的代表性视野。合并后的图像显示ENV阳性细胞和裂解的caspase-3细胞之间明显缺乏重叠。虚线框突出显示了一个罕见的细胞，该细胞同时具有ENV和裂解的caspase-3信号，在高倍镜下显示(底部，箭头），其中碎裂的细胞核在DAPI信号中是明显的。（比例尺，20μm）(D类,顶部)低倍放大显示DAPI、裂解caspase-3和ENV的代表性区域。合并后的图像显示ENV和裂解caspase-3之间缺乏重叠。虚线框突出显示了一个具有裂解caspase-3信号但没有ENV的细胞，在高倍镜下显示(底部，箭头），其中DAPI信号显示核膜外围的染色质浓缩。（比例尺，20μm）(E类)细胞死亡的量化。模拟感染切片中的细胞百分比或ENV百分比−和ENV+ZIKV-PR感染切片中的细胞在5dpi时对裂解caspase-3呈免疫阳性。每种条件下的生物复制平均值用水平线表示，分别为0.9%、0.7%和4.4%。在ZIKV感染的切片中，0.2-1%的细胞为ENV+; 看见SI材料和方法用于单元格编号。其中包括两名17%的独立捐赠者。采用Tukey多重比较测试的单向方差分析**P（P）≤ 0.01.
图2。
图2。
ZIKV在人脑发育的后期感染星形胶质细胞。(A类)ENV（绿色）在晚期神经发生/胶质细胞生成期间在人类器官型皮质切片中检测到ZIKV感染的低放大率概述。（比例尺，100μm）(B类)ENV量化+按区域划分的单元格(顶部)和单元格类型(底部)20%至22%。n个= 2; 平均值±SD[SI材料和方法; 如果短于线条厚度，则不会显示误差条(顶部、VZ和第二个OSVZ）]。(C类)观察到的易受ZIKV感染的细胞类型示意图摘要（绿色）。(D类和E类)免疫组织化学分析显示ENV阳性星形胶质细胞中的ZIKV感染（箭头，D类; 箭头，E）或ENV和非结构蛋白NS5，表明病毒复制活跃（填充箭头，E类). （比例尺，20μm）(F类)用ENV标记的小胶质瘤（箭头）。（比例尺，50μm）(G公司)少突胶质细胞前体细胞的ZIKV感染（OPCs，箭头）。（比例尺，20μm）(H（H）)感染后4、48和96小时，通过混合均质组织和条件培养基中的病灶形成分析，量化19-pcw皮质切片中的病毒生成。聚焦形成单元。两个独立的生物复制，每个时间点两个技术复制；平均值±SEM；采用Tukey多重比较测试的单因素方差分析*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01; 另请参见图S4F类. (我和J型)hPSC衍生星形胶质细胞中AXL阻断抗体存在时ZIKV-BR感染的分析(SI材料和方法). 注意，与IgG对照组相比，AXL阻断组ENV染色减少。（比例尺，100μm）(J型)实验的量化我; 另请参见图S5A类;n个= 3; 平均值±SEM；采用Tukey多重比较测试的单因素方差分析**P（P）≤ 0.01. (K)使用表达GFP-guide（g）RNA（非靶向对照）或AXL-gRNAs（dCas9-mediated knockdown）的U87-dCas9株敲除AXL后的ZIKV-PR感染；另请参见图S5B类; 独立转导产生的细胞系中的两个生物复制；平均值±SEM；采用Tukey多重比较测试的双向方差分析，不适用（不显著）***P（P）≤ 0.001.
图S4。
图S4。
妊娠中期前后人类初级皮质中ZIKV的细胞向性。(A类)ZIKV-PR感染未成熟星形胶质细胞（箭头，赖特)在妊娠中期晚期。[比例尺，50μm(左侧)和20微米(赖特).] (B类)ZIKV-BR感染星形胶质细胞的高倍放大示例（箭头）。（比例尺，10μm）(C类)ZIKV-CAM–孕中期晚期亚板中受感染的星形胶质细胞（箭头所示）。（比例尺，20μm）(D类)星形胶质细胞中ZIKV-PR的复制。具有NS5信号（填充箭头）的感染星形胶质细胞的高放大率示例显示病毒复制。罕见ENV的例子+没有明显NS5染色的细胞用空箭头表示。（比例尺，20μm）(E类)ZIKV感染后细胞内黄病毒非结构蛋白NS3的Western blot分析显示病毒复制。U87细胞全细胞提取物(左侧)培养皮质切片（17pcw；赖特)用SDS/PAGE分离，并用黄病毒NS3（～60 kDa）抗体和vinculin（负荷控制）抗体进行免疫印迹。(F类)在感染后4、48和96小时，通过混合均质组织和条件培养基的病灶形成分析，对两名捐赠者的皮质切片（19pcw）中的病毒生成进行量化；每个捐赠者每个时间点两次技术复制；平均值±SD。另请参见图2H（H）. (G公司)暴露于ZIKV-BR的孕中期晚期大脑中ENV的小胶质细胞免疫反应阳性。星号表示图2所示的面板F类（比例尺，50μm）(H（H）)暴露于ZIKV-PR（标尺，20μm）的大脑中ENV小胶质细胞免疫反应（箭头）(我)感染ZIKV-BR的少突胶质前体细胞（OPC）的低放大倍数概述。星号表示图2中所示的面板G公司（比例尺，100μm）(J型)ZIKV-PR感染神经元的高度放大示例（箭头）。（比例尺，10μm）
图3。
图3。
阿奇霉素治疗抑制胶质细胞中的ZIKV感染。(A类)用增加浓度的AZ处理U87细胞，并在不同的MOI（0.01、0.1和3，如图所示）下感染ZIKV-PR。通过流式细胞术测定48 hpi时ENV免疫染色细胞的感染细胞百分比，并将其归一化为未经处理的细胞（原始数据见图S6A类). 欧盟委员会50当MOI为3时，AZ介导的ZIKV感染减少值为5.1µM(n个=2），MOI为0.1时为2.9µM(n个=2）和2.1µM（对于0.01的MOI）(n个= 2); 平均值±标准偏差(B类)在MOI为3（如A类). 在48 hpi时，对细胞进行ENV蛋白（绿色）和细胞DNA（DAPI，蓝色）的免疫染色。（比例尺，100μm）(C类)用AZ拯救细胞活力。用AZ预处理U87细胞1h，然后在AZ存在的情况下以10的MOI感染ZIKV-PR。用CellTiter-Glo发光法在72 hpi下测量细胞活力。欧盟委员会50AZ介导的挽救细胞活力的值为7.1µM。最高浓度AZ（50µM）的数据点显示细胞活力降低，可能是由于药物毒性（图S6C类).n个= 2; 平均值±标准偏差(D类)AZ治疗降低病毒产生。用AZ预处理U87细胞1h，然后在有AZ存在的情况下以0.1或0.01的MOI感染ZIKV-PR。在0、24、48和72 hpi条件培养基中通过聚焦试验定量病毒产量；n个=每个MOI为2；平均值±标准差；采用Tukey多重比较测试的双向方差分析**P（P）≤ 0.01, ***P（P）≤ 0.001, ****P（P）≤ 0.0001.
图S5。
图S5。
AXL导致ZIKV感染。(A类)AXL支持星形胶质细胞的ZIKV感染。hPSC衍生星形胶质细胞在含有生长因子的培养基中培养(SI材料和方法)MOI为10时感染了ZIKV-BR或ZIKV-PR。条形图显示ENV的百分比+存在IgG对照或抗AXL阻断抗体的24 hpi细胞；n个= 3; 平均值±SEM；采用Tukey多重比较测试的单因素方差分析**P（P）≤ 0.01, ***P（P）≤ 0.001; 另请参见图2我–K. (B类)U87-dCas9-KRAB细胞中的AXL敲除。用SDS/PAGE分离表达GFP gRNA（非靶向）或五个AXL靶向gRNA的U87-dCas9细胞的全细胞提取物，并用AXL或GAPDH抗体进行免疫印迹（负载控制）；另请参见图2K. (C类)在含有AXL激酶抑制剂R428的1或3μM或载体的情况下，用20μM的MOI的ZIKV-PR感染U87细胞。在48 hpi时对细胞进行ENV蛋白免疫染色。（比例尺，100μm）
图S6。
图S6。
阿奇霉素可减少ZIKV感染、复制和病毒介导的细胞死亡。(A类)AZ可有效降低不同MOI的ZIKV感染。U87细胞用增加浓度的AZ处理，并在药物存在下用MOI为0.01、0.1或3的ZIKV-PR感染。在48 hpi时，对细胞进行ENV蛋白染色，并通过流式细胞术测定感染率。欧盟委员会50当MOI为3、0.1和0.01时，AZ介导的ZIKV感染减少值分别为5.1、2.9和2.1µM。n个= 2; 平均值±标准差(B类)欧盟委员会50因为ZIKV感染的AZ依赖性减少受病毒剂量的影响。欧共体50AZ值inA类和H（H）绘制为基线感染的函数。(C类)AZ对培养细胞有轻度毒性。U87细胞在规定浓度AZ的培养基中培养72小时。使用CellTiter-Glo发光法评估细胞活力和增殖。TC50U87细胞中AZ的计算值为53µM。n个= 2; 平均值±标准偏差(D类)用AZ拯救细胞活力。用AZ预处理U87细胞1小时，然后在MOI为10的AZ存在下感染ZIKV-BR 72小时。用CellTiter-Glo发光法测定细胞活力。欧盟委员会50AZ介导的细胞存活挽救值为7.2µM。n个= 3; 平均值±SEM(E类–G公司)AZ可降低星形胶质细胞的高水平感染。(E类)用规定浓度的AZ处理hPSC衍生的星形胶质细胞至少1小时。处理后，在药物存在的情况下，用MOI为1的ZIKV-PR感染细胞。在48 hpi时，对细胞进行ENV蛋白染色，并通过免疫组织化学定量测定感染率。欧盟委员会50对于AZ介导的这种细胞类型的感染减少，计算为15µM（内插）。n个= 3; 平均值±SEM(F类)AZ对培养的星形胶质细胞有轻度毒性。hPSC衍生的星形胶质细胞在AZ浓度增加的情况下生长72小时。使用CellTiter-Glo发光法评估细胞活力和增殖。TC50在44µM时计算星形胶质细胞中的AZ。n个= 2; 平均值±标准偏差(G公司)hPSC衍生的星形胶质细胞在指示浓度的AZ存在下以1的MOI感染ZIKV-PR。在48 hpi时对细胞进行ENV蛋白表达的免疫染色并成像。（比例尺，100μm）(H（H）)AZ、达托霉素和索福布韦的比较。U87细胞在感染ZIKV-PR之前，用浓度增加的药物处理1小时，MOI为1，有药物存在。在48 hpi时，对细胞进行ENV蛋白染色，并通过流式细胞术测定感染率。欧盟委员会50对于达托霉素，ZIKV感染减少值为2.2μM，AZ为6.5μM，而索福布韦为12.4μM。请注意，AZ和达普霉素在浓度低于5µM时的感染减少情况相似，但达普霉素有一定的效果，仍有46%的感染率，而AZ在20µM下继续将感染率降低至4%。n个= 2; 平均值±标准差。
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