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.2016年11月28日;11(11):e0166920。
doi:10.1371/journal.pone.0166920。 电子收集2016。

类风湿关节炎中PIWIL蛋白和PIWI-Interacting RNA的表达与调控

附属公司

类风湿关节炎中PIWIL蛋白和PIWI-Interacting RNA的表达与调控

伦卡·普列什蒂洛娃等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

目标:argonaute蛋白的PIWIL(P元素诱导的弱睾丸样蛋白)亚家族对于Piwi相互作用RNA(piRNA)的生物发生及其在生殖系发育过程中沉默转座子的功能至关重要。在这里,我们探讨了它们在类风湿关节炎(RA)中的存在和调节。

方法:采用实时PCR、免疫荧光和Western blot分析PIWIL基因在RA、OA滑膜组织和滑膜成纤维细胞中的表达。通过下一代小RNA测序(NGS)量化piRNAs的表达。研究了PIWIL基因沉默后PIWI/piRNAs的调控、LINE-1的增殖和甲基化。

结果:PIWIL2和4mRNA在RA和OA患者的滑膜组织和SF中表达相似。然而,在蛋白质水平上,只有PIWIL4在SF中强烈表达。使用NGS在所有SF中鉴定出多达300个piRNAs,RA和OASF之间的表达水平没有显著差异。有趣的是,对检测到的piRNAs共同表达的分析显示,RASF中piRNA-823、-4153和-16659的表达调控模式不太严格。在RASF和OASF中,TNFα+IL1β/TLR配体刺激进一步显著增加PIWIL2和4mRNA的表达水平,并且在Poly(I:C)刺激下显著(4倍)诱导piRNA-16659。PIWIL2/4的沉默既不影响LINE-1甲基化/表达,也不影响RASF的增殖。

结论:我们在滑膜成纤维细胞中检测到一类新的小调节RNA(piRNAs)及其特异性结合伙伴(PIWIL2/4)。RASF中piRNAs共同表达的差异调节以及先天性免疫刺激物对piRNA/Piwi-proteins的诱导提示了其在炎症过程中的作用。

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数字

图1
图1。PIWIL基因A1的表达。
RA和OA患者滑膜组织中PIWIL2和PIWIL4的mRNA表达。RAST 5.3和OAST 5.5中的平均dCt-PIWIL2;RAST 3.6和OAST 2.9中的平均dCt-PIWIL4。PIWIL1和PIWIL3未表达。答2:。RA和OA患者滑膜成纤维细胞PIWIL2和PIWIL4的mRNA表达。RASF 2.2和OASF 1.3中的平均dCt PIWIL2;RASF 1.3和OASF 1.2中的平均dCt PIWIL4。PIWIL1和PIWIL3未表达。B。Western blot检测到PIWIL4蛋白存在于细胞核的RASF和OASF中,而不存在于细胞质中。PIWIL2表达较弱。C、。免疫荧光显示PIWIL4蛋白主要存在于细胞核和核周区域(RASF培养的典型示例)。
图2
图2。PIWI相互作用RNA的表达
答:。小RNA Illumina测序结果:所有滑膜成纤维细胞(SF)的阅读长度分布在23和30 nt时达到峰值。piRNAs没有聚集9个RASF和9个OASF。B。9个RASF和9个OASF中piRNAs和RNU6-6P(内源性控制)的相关矩阵。单个piRNAs的RPKM相互关联,显示了每对的相关系数R。只有平均RPKM≥500(n=38)的piRNA被纳入本分析。强正相关(0.75≤R)以深灰色突出显示,0.5≤R<0.75为浅灰色。在RASF中,与OASF相比,piRNA共同表达的调节不那么严格。在9个RASF和9个OASF中计算每个piRNA的SUMA(∑)R。通过计算∑R(OASF)和∑R的δ(Δ)来比较RASF和OASF中piRNAs的调节。受调控最不严格的piRNA是piR-4153、piR-16659和piR-823(Δ∑R 18.1、10.7和9.7)。C、。在另外5个RASF和5个OASF中,piRNAs表达如下(平均dCt与RNU6B RA/OA):piR-823(0.6/2.8)、piR-4153(-0.6/-0.4)、piR-16659(4.3/5.2)和piR-16735(-7.3/-5.9)。在肿瘤细胞系(THP-1、Jurkat、MCF-7、HEK293、HepG2和HeLa)中也检测到类似的表达。
图3
图3。PIWIL/piRNAs的调节和功能
答:。促炎细胞因子和TLR配体的刺激可提高RASF和OASF中PIWIL4 mRNA的水平。TNFα联合IL1β诱导的RASF/OASF中PIWIL4 mRNA 1.9倍(p=0.0035)/1.7倍(p=0.0075);LPS为2.1倍(p=0.0262)/2.6倍(p+0.0249),Poly(I:C)为3.2倍(p=0.0017)/3.4倍(p=0.0133)。●=RASF,○ = 办公自动化系统B。在蛋白水平上,我们证实在RASF核提取物中用TLR配体刺激后PIWIL4上调,细胞质提取物中未检测到PIWIL4。
图4
图4。炎症刺激物对RASF和OASF中piRNAs的调节
经Poly(I:C)刺激后,RASF和OASF中piR-16659的表达增加了4倍(p=0.001),其他piRNAs水平在TNFα+IL1β、LPS或Poly(I:C)刺激24小时后没有显著变化。● = RASF、,○ = 办公自动化系统
图5
图5。PIWIL沉默对增殖和甲基化的影响
答:。PIWIL2和4个基因沉默RASF(n=4)中的细胞增殖。B。PIWIL2和PIWIL4沉默没有改变LINE-1反转录转座子的表达或甲基化(n=3;平均LINE1甲基化106%,平均mRNA表达0.74倍)。用DNA去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-AZA)处理RASF 1周作为阳性对照。

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引用人

工具书类

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