Somatic increase of CCT8 mimics proteostasis of human pluripotent stem cells and extends C. elegans lifespan

doi:10.1038/ncomms13649

.2016年11月28日7:13649。

doi:10.1038/ncomms13649。

CCT8的体细胞增加模拟人类多能干细胞的蛋白质平衡并延长秀丽线虫的寿命

附属公司

¹科隆老年相关疾病细胞应激反应卓越集群（CECAD），科隆大学，Joseph Stelzmann Strasse 26，科隆50931，德国。
²德国海德堡大学医院Neuenheimer Feld 669，内科III和Klaus Tschira计算心脏病学研究所，生物信息学和系统心脏病科，邮编69120。

PMID： 27892468
预防性维修识别码：项目经理5133698
内政部： 10.1038/ncomms13649

CCT8的体细胞增加模拟人类多能干细胞的蛋白质平衡并延长秀丽线虫的寿命

阿里雷扎·诺莫哈马迪等。国家公社. 2016.

.2016年11月28日7:13649。

doi:10.1038/ncomms13649。

附属公司

¹科隆老年相关疾病细胞应激反应卓越集群（CECAD），科隆大学，Joseph Stelzmann Strasse 26，科隆50931，德国。
²德国海德堡大学医院Neuenheimer Feld 669，内科III和Klaus Tschira计算心脏病学研究所，生物信息学和系统心脏病科，邮编69120。

PMID： 27892468
预防性维修识别码：项目经理5133698
内政部： 10.1038/ncomms13649

摘要

人类胚胎干细胞可以无限期复制，同时保持其未分化状态，因此在培养中是不朽的。这一能力可能需要避免蛋白质稳态（蛋白质稳态）的任何不平衡，否则会损害干细胞的特性。在这里，我们发现人类多能干细胞表现出增强的TRiC/CCT复合物组装，这是一种有助于10%蛋白质组折叠的伴侣蛋白。我们发现单个亚单位（CCT8）的异位表达足以增加TRiC/CCT组装。此外，需要增加TRiC/CCT复合物，以避免突变亨廷顿蛋白的聚集。我们进一步表明，CCT8在体细胞组织中的表达增加以TRiC/CCT依赖的方式延长秀丽隐杆线虫的寿命。CCT8的异位表达还改善了与年龄相关的蛋白质沉积消亡，并纠正了亨廷顿病蠕虫模型中的蛋白质沉积缺陷。我们的结果表明，蛋白质平衡是一个共同的原则，它将生物体的寿命与人类胚胎干细胞的永生联系在一起。

PubMed免责声明

数字

**图1。CCT亚基的表达在分化过程中减少。**
(一,**c（c）**,**e（电子）**)用CCT8、CCT7、CCT6A、CCT2和CCT1抗体进行免疫印迹分析。β-肌动蛋白是负载控制。这些图像代表了两个独立的实验。在一,**c（c）**用H9人胚胎干细胞系进行分化，而在**e（电子）**我们使用了H1 hESCs。(b条)*CCT公司*H9 hESCs的亚单位相对表达代表三个独立实验的平均值±标准偏差。(d日)*CCT公司*H9 hESCs的亚单位相对表达代表平均值±标准差(n个=7个独立实验）。(**（f）**)*CCT公司*H1-hESCs的亚单位相对表达代表三个独立实验的平均值±标准偏差。(克)CCT亚基的蛋白质水平在H9 hESCs中随传代而无差异。β-actin是负荷控制。这些图像代表了两个独立的实验。(小时)数据表示H9 hESCs第31–33段相对表达水平的平均值±标准偏差(n个=3个独立实验）。所有统计比较均由Student’st吨未配对样品的测试。*P（P）*值：**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001, *****P（P）*<0.0001.

**图2。CCT8的异位表达足以增加TRiC/CCT组装。**
(一)H9 hESCs和NPC提取物的天然凝胶电泳，然后用CCT抗体进行免疫印迹。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析提取物的总CCT亚基水平和β-肌动蛋白负荷控制。这些图像代表了三个独立的实验。(b条)CCT蛋白水平相对于CCT1的无标签定量（LFQ）。所有检测到的CCT亚基均通过其对数进行量化₂LFQ强度相对于CCT1的倍数变化。图表示平均值±s.e.m.（hESCs(n个=9），NPC(n个=6)). 所有统计比较均采用Student t检验对未配对样本进行。P值：**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001. (**c（c）**)HEK293T细胞提取物的天然凝胶电泳，然后用CCT1抗体进行免疫印迹（显示同一膜的两个不同暴露时间）。提取物通过SDS-PAGE和免疫印迹分析总CCT8和CCT1亚单位水平。β-actin是负荷控制。这些图像代表了三个独立的实验。

**图3。CCT亚基的敲除影响hESCs的多能性。**
(一)H9人胚胎干细胞多能性标记的实时PCR分析。图（NT shRNA的相对表达）表示至少三个独立实验的平均值±标准偏差。击倒*CCT8型*(n个=3),*闭路电视2*(n个=3),*CCT6A型*(n个=4）和*CCT7型*(n个=4）降低多能性标记的表达。(b条)CCT7基因敲除导致OCT4蛋白水平下降。β-actin是负荷控制。这些图像代表了三个独立的实验。(**c（c）**)H9 hESCs生殖层标记的实时PCR分析（与NT shRNA的相对表达）。图表表示四个独立实验的平均值±标准偏差。所有的统计比较都是由Student的t吨未配对样品的测试。*P（P）*值：**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001, *****P（P）*<0.0001.

**图4。CCT亚单位的敲除会损害多能干细胞的蛋白质平衡。**
(一)用HTT和β-肌动蛋白抗体对对照和HD-iPSC裂解物进行Western blot分析。箭头表示突变的polyQ-expended HTT。这些图像代表了三个独立的实验。(b条)在HD polyQ180表达的iPSCs中，与正常HTT拷贝相比，突变HTT的水平显著降低。通过使用检测polyQ扩增突变HTT的抗体来确认polyQ180 HTT的表达。这些图像代表了三个独立的实验。(**c（c）**)滤器陷阱分析表明，与对照iPSC相比，HD-iPSCs的polyQ聚集体水平没有增加（通过抗polyQ扩张疾病标记抗体检测到）。然而，单个CCT亚基的敲除触发了polyQ聚集体的积累。这些图像代表了三个独立的实验。(d日)HD polyQ71 iPSC#1系中不同CCT亚基的敲除导致polyQ聚集体的类似增加。右侧面板：使用HTT抗体和β-肌动蛋白负荷控制进行SDS-PAGE分析。这些图像代表了三个独立的实验。(**e（电子）**)单个CCT亚基的敲除触发了polyQ71 iPSC#2和polyQ180 iPSC中polyQ聚集体的积累。右侧面板：使用polyQ-expansion疾病标记抗体确认突变HTT的总蛋白水平在CCT亚基敲除时没有变化。这些图像代表了两个独立的实验。

**图5。躯体表达增加*cct-8型*诱导TRiC/CCT组装并延长寿命。**
(一)数据表示相对表达水平的平均值±标准偏差*GFP（OE）*蠕虫(n个=4个独立实验）。Student’s进行了统计比较t吨未配对样品的测试。*P（P）*值：***P（P）*<0.01, *****P（P）*<0.001. (b条,**c（c）**,d日)每个寿命图显示了单个代表性实验的Kaplan–Meier生存图。在每幅图中，实验动物和对照动物平行生长。n个=未经审查的动物总数/每次实验中观察到的动物总数（未经审查+审查）。*P（P）*数值是指在单个寿命试验中的实验动物和对照动物。有关寿命试验的统计分析、复制数据和独立OE线结果，请参阅补充数据3。(b条)*cct-8（运行经验）*在20岁时延长寿命 °C（对数秩，*P（P）*<0.0001).GFP（OE）：中值=14，n个=73/96;*cct-2，GFP（OE）*：中值=14，n个=65/96;*cct-7，GFP（OE）*：中值=13，n个=46/74;*cct-8，GFP（OE）*：中值=16，n个=70/96. (**c（c）**)两者都有*cct-8（运行经验）*和*cct-2（运行经验）*蠕虫比对照活得更长*GFP（OE）*25时的应变 °C（对数秩，*P（P）*<0.0001).cct-8（运行经验）蠕虫的寿命比*cct-2（运行经验）*和其他*cct（OE）*应变（对数秩，*P（P）*<0.0001).GFP（OE）：中值=10，n个=89/96;*cct-2，绿色荧光蛋白（OE）*：中值=11，n个=79/96;*cct-5，GFP（OE）*：中值=11，n个=42/50;*cct-7，GFP（OE）*：中值=9，n个=56/77;*cct-8，GFP（OE）*：中值=14，n个=82/96. (d日)击倒*cct-6型*减少因*cct-8（运行经验）*（对数秩，*P（P）*=0.0001). 相比之下*cct-6型*不会缩短*GFP（OE）*蠕虫。RNAi在成年后第1天开始。*总发电量*联邦调查局人员*空向量*RNAi细菌：中值=10，n个=74/96;*GFP（OE）*联邦调查局人员*cct-6型*RNAi细菌：中位数=11，n个=73/96;*cct-8，GFP（OE）*联邦调查局人员*空向量*细菌：中位数=13，n个=77/96;*cct-8，GFP（OE）*联邦调查局人员*cct-6型*RNAi细菌：中位数=12，n个=79/96. (**e（电子）**)天然凝胶电泳*GFP（OE）*和*cct-8，GFP（OE）*蠕虫提取物，然后用CCT-1抗体进行免疫印迹（显示同一膜的两个不同暴露时间）。的过度表达*cct-8型*以两个堆叠环的形式增加TRiC/CCT的组装*表示～475的复合体在蠕虫裂解物中强烈检测到的kDa。分子量表明该信号对应于单环TRiC/CCT组装形式。这些图像代表了两个独立的实验。

**图6。*cct-8型*确定老化过程中的蛋白毒性应激抵抗力，并保护其免受polyQ聚集。**
(一)几个*中央控制室*亚基随着年龄的增长而减少。相比之下，我们在*cct-1型*和*enpl-1*，的*秀丽线虫*人类伴侣的直系亲属*热休克蛋白90B1*数据表示20岁时生长的第1天成年蠕虫的相对表达水平的平均值±s.e.m °C（摄氏度）(n个=4个独立实验）。这些实验是用无菌对照菌株进行的*fer-15（b26）II；fem-1（hc17）。*(b条)当受到热应力（34 °C）在成年后第1天*cct-8（运行经验）*和*cct-2（运行经验）*与对照菌株相比，蠕虫的存活率相似(*GFP（OE）*：中值=11，n个=70/72;*cct-2，GFP（OE）*：中位数=10，n个=71/72;*cct-8，GFP（OE）*：中值=9，n个=70/72). (**c（c）**)相比之下，*cct-8（运行经验）*（对数秩，*P（P）*<0.0001）和*cct-2（运行经验）*（对数秩，*P（P）*=0.0036）在成年第5天受到热应激时，蠕虫的存活时间比对照菌株长(*GFP（OE）*：中值=14，n个=57/58;*cct-2，GFP（OE）*：中值=16，n个=57/57;*cct-8，GFP（OE）*：中值=17，n个=57/57). (d日)*hsf-1型-*RNAi处理*闭路电视（OE）*与相同处理下的对照菌株相比，蠕虫是长寿的（log秩，*P（P）*<0.0001). RNAi在成年后第1天启动。*GFP（OE）*联邦调查局人员*hsf-1型*RNAi细菌：中位数=7，n个=90/96;*cct-2，GFP（OE）*联邦调查局人员*hsf-1型*RNAi细菌：中位数=8，n个=82/96;*cct-8，GFP（OE）*联邦调查局人员*hsf-1型*RNAi细菌：中位数=9，n个=72/96. (**e（电子）**)的异位表达*cct-8型*和*cct-2型*提高25岁时生长的polyQ67蠕虫的运动能力摄氏度。在左边的面板中，每个点代表一只3天成年动物在30天内的平均痛击率 s.在右侧面板中，条形图表示这些数据的平均值±标准误差(*GFP（OE）；问题67*(n个=37),*cct-2，GFP（OE）；问题67*(n个=38),*cct-8，GFP（OE）；问题67*(n个=38)). 所有统计比较均由Student’st吨未配对样品的测试。*P（P）*值：****P（P）*<0.001, *****P（P）*<0.0001. (**（f）**)过滤器陷阱表明*cct-8型*OE导致polyQ聚集体减少（通过抗GFP抗体检测）。右侧面板：使用GFP抗体和α-微管蛋白负荷控制进行SDS-PAGE分析。这些图像代表了两个独立的实验。有关寿命和压力测定实验的统计分析和重复数据，请参见补充数据3。

**图7。TRiC/CCT是长寿的长寿表型所必需的*秀丽线虫*突变体。**
(一)击倒*cct-8型*缩短IIS的寿命*（daf-2）*和DR（第2年）20岁时长寿的变异蠕虫 °C（对数秩，*P（P）*<0.0001). N2（野生型蠕虫）+矢量RNAi：中位数=17，n个=72/9; 氮气+*中央控制室-*8 RNAi：中值=19，n个=66/96;*eat-2（公元1116年）*+矢量RNAi：中值=23，n个=66/96;*eat-2（公元1116年）*+*中央控制室-*8 RNAi：中值=18，n个=67/96;*daf-2（e1370）*+矢量RNAi：中值=37，n个=68/96;*daf-2（e1370）*+*中央控制室-*8 RNAi：中值=31，n个=77/96. (b条)击倒*cct-8型*降低了带有细菌的突变蠕虫的寿命（对数秩，*P（P）*<0.0001）。*glp-1（e2141）*+矢量RNAi：中值=21，n个=88/96;*glp-1（e2141）*+*中央控制室-*8 RNAi：中值=16，n个=86/96. (**c（c）**)野生型和细菌标记CCT-1抗体的性腺和肠道免疫染色(*glp-1（e2141）*)蠕虫。与野生型线虫相比，长寿命的细菌粘附线虫在肠道中增加了CCT-1的水平。细胞核用DAPI染色。白色箭头表示性腺，红色箭头表示肠道。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。比例尺表示50 微米。(d日)在控制下表达的GFP代表性图像*cct-8型*成人野生型和种系标记中的启动子(*glp-1（e2141）*)蠕虫。比例尺代表100 微米。在**c（c）**,d日这些图像代表了三个独立的实验。寿命试验的统计分析和复制数据见补充数据3。

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1. Powers E.T.、Morimoto R.I.、Dillin A.、Kelly J.W.和Balch W.E.。蛋白质组缺陷疾病的生物和化学方法。每年。生物化学评论。78, 959–991 (2009).-公共医学
1. Lopez-Otin C.、Blasco M.A.、Partridge L.、Serrano M.和Kroemer G.衰老的标志。单元格1531194-1217（2013）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Vilchez D.、Saez I.和Dillin A.蛋白质清除机制在机体衰老和年龄相关疾病中的作用。国家公社。5, 5659 (2014).-公共医学
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