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.2016年11月18日；11（11）：e0166823。
doi:10.1371/journal.pone.0166823。 2016年eCollection。

Caspase依赖性和Caspase非依赖性通路参与镉诱导的大鼠近端肾小管细胞凋亡

刘刚（Gang Liu） 1, 邹慧（音） 1, Tongwang Luo公司 1, 梦飞龙 1, 卞建春 1, 刘学忠 1, 顾建红 1, 颜元 1, 宋瑞龙 1, 王毅（Yi Wang） 1, 朱家桥 1, 刘宗平 1
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Caspase依赖性和Caspase非依赖性通路参与镉诱导的大鼠近端肾小管细胞凋亡

刘刚（Gang Liu）等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

本研究旨在研究镉是否诱导caspase非依赖性凋亡，以及caspase依赖性和caspase不依赖性凋亡途径之间的关系。镉（1.25-2.5μM）诱导大鼠近端肾小管（rPT）细胞氧化应激，如活性氧水平所示；N-乙酰半胱氨酸阻止了这种情况。环孢菌素A（CsA）抑制线粒体通透性转换孔开放和凋亡；线粒体超微结构破坏，线粒体细胞色素c（cytc）移位到细胞质，随后caspase-9和caspase-3激活。Z-VAD-FMK阻止caspase-3激活和凋亡，降低BNIP-3（Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3）表达水平和凋亡诱导因子/核酸内切酶G（AIF/Endo G）易位。同时，镉在线粒体和细胞质AIF/Endo G向细胞核的易位中诱导了显著的BNIP-3表达。BNIP-3沉默显著阻止AIF和Endo G移位，并降低凋亡率、cyt c释放、caspase-9和caspase-3激活。这些结果表明，BNIP-3参与caspase非依赖性凋亡途径，位于AIF/Endo G的上游；caspase-dependent和caspase-independent通路均参与了镉诱导的rPT细胞凋亡并发挥协同作用。

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数字

图1
图1
（a） 镉诱导rPT细胞产生ROS的剂量依赖性。（b） 在没有或存在NAC（100μM）的情况下，镉（2.5μM）处理12小时后rPT细胞内的ROS水平。使用带有FL-1过滤器的流式细胞仪测量DCF荧光。镉诱导MPTP开放的共焦显微镜。（c） 镉诱导的rPT细胞的典型共焦图像。（d） 钙黄绿素荧光定量。与对照组相比，对钙调素荧光值进行量化，其中荧光值设置为100%。（e） 镉暴露后rPT细胞线粒体的典型电子显微照片（×6600倍放大）。图中显示了膜破裂（细箭头）、肿胀和损坏的嵴（粗箭头）。荧光结果表示为平均荧光强度，是三个单独实验的平均值±SD，每个实验一式三份（n=9）*P（P）< 0.05, **P（P）与对照组相比<0.01。
图2
图2。在没有或存在CsA（5μM）的情况下，镉（2.5μM）处理12小时后MPTP开放的共焦显微镜。
（a） 镉诱导的rPT细胞的典型共焦图像。（b） 钙黄绿素荧光的定量。相对于对照对钙黄绿素荧光值进行量化，其中荧光值设定为100%。（c） 在不存在或存在CsA（5μM）的情况下，用膜联蛋白V–FITC/PI染色检测12小时镉（2.5μM）处理后的细胞凋亡率。（d） 凋亡细胞的百分比。结果是三个单独实验的平均值±SD，每个实验重复三次（n=9）**P（P）与对照组相比<0.01。
图3
图3。镉诱导线粒体cyt c释放到细胞质，随后在rPT细胞中激活caspase-9和caspase-3。
（a，c）cyt c、裂解caspase-9和裂解caspase-3的典型蛋白印迹。（b，d）cyt c、裂解caspase-9和裂解caspase-3蛋白印迹的定量分析；控件的灰度设置为1。利用三个独立实验的图像进行定量分析（平均值±SD，n=3）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及##P（P）与对照组相比<0.01。
图4
图4。镉处理12小时后，镉诱导BNIP-3表达、细胞质AIF和Endo G向细胞核移位。
（a、c、e）BNIP-3、AIF和Endo G蛋白印迹的代表性图像。（b，d，f）BNIP-3、AIF和Endo G的定量分析；控件的灰度设置为1。（g） 镉处理（12 h）剂量依赖性地触发AIF核移位。rPT细胞用抗AIF抗体和Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG染色。荧光显微镜下用DAPI染色评估AIF核转位。比例尺：50μm。在缺乏或存在BNIP-3小干扰RNA（siRNA）的情况下，BNIP-3沉默对镉处理12小时后BNIP-3表达变化、细胞质AIF和Endo G向细胞核移位的影响。（h，j，l）BNIP-3、AIF和Endo G蛋白印迹的代表性图像。（i，k，m）BNIP-3、AIF和Endo G的定量分析；控件的灰度设置为1。结果来自三个独立实验（平均值±标准偏差，n=3）**P（P）< 0.01,#P（P）<0.05，以及##P（P）与对照组相比<0.01。
图5
图5。Z-VAD-FMK对镉诱导的rPT细胞凋亡的影响。
（a） 在没有或存在Z-VAD-FMK的情况下，镉处理12小时后裂解caspase-3蛋白印迹的代表性图像。（b） 裂解半胱天冬酶-3的定量分析；控件的灰度设置为1。（c） 流式细胞术评估含/不含Z-VAD-FMK的镉处理12小时后rPT细胞凋亡率。（d） 凋亡细胞的百分比。结果表示为三个独立实验的平均值±标准差，每个实验一式三份（n=9）**P（P）与对照组相比P<0.01。
图6
图6。Z-VAD-FMK对镉处理12小时后BNIP-3表达和细胞质AIF转运到细胞核的影响。
（a） BNIP-3蛋白印迹的代表性图像。（b） BNIP-3的定量分析；控件的灰度设置为1。（c） 使用/不使用Z-VAD-FMK的12小时镉处理引发AIF核移位。rPT细胞用抗AIF抗体和Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG染色。荧光显微镜下用DAPI染色评估AIF核转位。比例尺：50μm。结果来自三个独立实验（平均值±标准偏差，n=3）**P（P）与对照组相比<0.01。
图7
图7。BNIP-3沉默对镉诱导的细胞凋亡、线粒体cyt c释放到细胞质以及caspase-9和caspase-3表达变化的影响。
（a） 流式细胞术评估镉和/或BNIP-3 siRNA处理12小时后rPT细胞凋亡率。（b） 凋亡细胞的百分比。（c，e）cyt c、caspase-9和caspase-3蛋白印迹的代表性图像。（d，f）cyt c、caspase-9和caspase-3的定量分析；控件的灰度设置为1。结果来自三个独立的实验（平均值±SEM，n=3）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及##P（P）与对照组相比<0.01。
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