Neutralizing human antibodies prevent Zika virus replication and fetal disease in mice

doi:10.1038/nature20564

.2016年12月15日；540(7633):443-447.

doi:10.1038/nature20564。 Epub 2016年11月7日。

中和人抗体预防寨卡病毒复制和小鼠胎儿疾病

附属公司

¹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心儿科。
²范德比尔特疫苗中心，范德比尔特大学医学中心，美国田纳西州纳什维尔。
^三美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系。
⁴美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院妇产科。
⁵美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系。
⁶Integral Molecular，美国宾夕法尼亚州费城。
⁷美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院分子微生物学系。
⁸美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院人类免疫学和免疫治疗项目中心。
⁹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学病理学、微生物学和免疫学系。

PMID： 27819683
预防性维修识别码： PMC5583716
内政部： 10.1038/性质20564

中和人抗体预防寨卡病毒复制和小鼠胎儿疾病

戈帕尔·萨帕尔普等。性质. 2016.

.2016年12月15日；540(7633):443-447.

doi:10.1038/nature20564。 Epub 2016年11月7日。

附属公司

¹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心儿科。
²美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心范德比特疫苗中心。
^三美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系。
⁴美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院妇产科。
⁵美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系。
⁶Integral Molecular，美国宾夕法尼亚州费城。
⁷美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院分子微生物学系。
⁸美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院人类免疫学和免疫治疗项目中心。
⁹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学病理学、微生物学和免疫学系。

PMID： 27819683
预防性维修识别码： PMC5583716
内政部： 10.1038/性质20564

摘要

寨卡病毒（ZIKV）是一种新出现的蚊子传播的黄病毒，可导致严重疾病，包括妊娠期先天性出生缺陷。为了开发抗ZIKV的候选治疗药物，我们从先前感染ZIKV患者中分离出一组人类单克隆抗体。我们表明，抗体子集可识别包膜（E）蛋白上的不同表位，并表现出强大的中和活性。最具抑制性的抗体之一，ZIKV-117，广泛中和了与非洲和亚裔美国人血统相对应的ZIKV菌株的感染。表位定位研究表明，ZIKV-117在E蛋白二聚体界面上识别出一个独特的四级表位。我们评估了ZIKV-117对怀孕和非怀孕小鼠的治疗效果。单克隆抗体治疗显著降低了小鼠的组织病理学、胎盘和胎儿感染以及死亡率。因此，中和人抗体可以防止母婴传播、感染和疾病，并揭示基于结构的合理疫苗设计工作的重要决定因素。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者们宣布了相互竞争的经济利益：详情可在论文的在线版本中获得。

数字

**扩展数据图1。人单克隆抗体与寨卡病毒E蛋白、E DIII或E-FLM的结合**
单克隆抗体由竞争结合基团A到D组成。纯化后的单克隆抗体按ELISA方法所述与不同抗原结合。对数据进行了非线性回归分析，绘制的数据为平均值和标准差。

**扩展数据图2。ZIKV单克隆抗体的高分辨率表位定位**
一构建了ZIKV包膜蛋白的丙氨酸扫描突变文库，其中prM/E的每个氨基酸分别突变为丙氨酸（丙氨酸突变为丝氨酸），表达结构排列成384孔板，每个孔一个突变。使用Intellicyt高通量流式细胞仪测量来自竞争组A–D的五个单克隆抗体对在HEK-293T细胞中表达的ZIKV prM/E突变库中的每个克隆进行免疫反应性测试。这里显示了五种单克隆抗体中的每一种与鉴定这些单克隆抗体表位残基的ZIKV E蛋白突变体的反应性。每个丙氨酸突变体的mAb反应性表示为mAb与野生型ZIKV prM/E反应性的百分比。相对于野生型ZIDV prM/E，反应性<30%的克隆被确定为对mAb结合至关重要。条形图表示至少两个重复数据点的平均值和范围。B族单克隆抗体ZIKV-116与野生型ZIKV E DIII的结合(b条)或DIII LR突变体(**c（c）**)与小鼠单克隆抗体ZV-2和ZV-54进行比较。DIII-LR突变降低了ZIKV-116的结合。绘制的数据为平均值±标准差。

**扩展数据图3。人单克隆抗体与DENV感染的C6/36细胞的结合**
C6/36细胞感染DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4或模拟感染。用指示的抗ZIKV单克隆抗体、同型阴性对照（hCHK-152）或阳性对照（DENV交叉反应抗体；嵌合人E60（chE60））对细胞进行染色，并用流式细胞术进行处理。这些数据代表了两个独立的实验。方框中的数字表示阳性染色细胞的比例。

**扩展数据图4。ZIKV-117或PBS处理的妊娠小鼠胎盘或胎头组织中人IgG的检测**
如图3所示，野生型雌性小鼠与野生型雄性交配，并监测其怀孕情况。在E5.5时，用抗Ifnar1单克隆抗体和PBS或250μg ZIKV-117处理母鼠。一天后（E6.5），用10^三ZIKV-Dakar的FFU。胎儿和胎盘(n个=4个）收集在E13.5上，均质，并通过ELISA检测人类IgG。在包有ZIKV E蛋白的ELISA板上捕获组织中的人抗体，并使用山羊抗人IgG（Fc特异性）抗体进行检测。抗体的数量通过与使用稀释系列中纯化的ZIKV-117构建的标准曲线进行比较来确定。对每个小鼠组织进行四次重复测量，并对结果进行平均。图表表示每组3只小鼠的平均值+s.e.m。

**扩展数据图5。野生型和LALA突变抗体的比较**
一，与重组人FcγR1结合。在与重组人FcγRI的ELISA结合试验中，证实了LALA变体IgG的结合功能被取消。ZIKV-117野生型与FcγR结合，而ZIKV-117 LALA抗体没有。另一种人类单克隆抗体CKV063的野生型和LALA版本被用作对照。与人类FcγRI结合是两个实验中的一个代表性实验，误差条表示三份技术复制品的标准偏差。b条，中和分析。野生型ZIKV-117和LALA抗体表现出等效的中和活性*在体外*相互之间以及杂交瘤衍生抗体。中和分析是两个独立实验的代表，共完成三次。

**扩展数据图6。现场杂交*伊夫纳1*^+/负极ZIKV-Brazil接种和ZIKV-117治疗后的胎盘**
如图3a所示，*伊夫纳1*^−/−雌性小鼠与野生型雄性交配并监测其妊娠情况。在E5.5时，用250μg hCHK-152同型对照或ZIKV-117处理母鼠。在E6.5，母鼠接种了10个^三ZIKV-Brazil的FFU。收集的胎盘在室温下固定在10%中性缓冲福尔马林中，并嵌入石蜡中。至少三个来自不同胎龄的胎盘在指定的处理方法下进行切片就地使用阴性或ZIKV特异性RNA探针进行杂交染色。低功率（标尺，500μm）和高功率（标杆，50μm）图像依次显示。

**图1。人类抗体和B细胞对ZIKV感染的反应**
一,b条，在ELISA中检测先前感染过ZIKV的人的血清样本与ZIKV E蛋白的结合(一)（有两个技术副本）和中和ZIKV(b条)（至少两个独立重复，一式三份）。受试者1001在结合测定中具有最高的终点滴度，并且显示出有效的中和活性。受试者657为无ZIKV接触史的对照组。**c（c）**对来自受试者1001的Epstein–Barr病毒（EBV）转化的B细胞培养物上清液进行测试，以确定其是否与ZIKV E或ZIKV E或相关黄病毒E蛋白的DIII结合；WNV反应性克隆和除一个外的所有DENV反应B细胞系也与ZIKV E蛋白反应。用405nm处的阈值吸光度值测定针对每种病毒蛋白的抗原特异性细胞的频率(A类_405纳米)如图所示，为1.5。d日在另外四个单独的B细胞转化实验中，测定了B细胞与完整的ZIKV E或E-FLM反应的频率。

**图2。抗ZIKV单克隆抗体的鉴定**
一，我们在结合、中和和竞争结合分析中检测了29个单克隆抗体。欧盟委员会₅₀针对ZIKV E和IC₅₀显示了针对H/PF/2013菌株的中和抗体（以蓝色突出显示）（通过焦点减少中和试验）。根据竞争结合分析，mAb分为四组（A、B、C或D）。这些值是比赛期间发生的绑定与非比赛绑定的百分比，标准化为100%，比赛范围由方框颜色表示。黑色填充框表示强竞争对（剩余绑定<30%），灰色填充框表示中间竞争（剩余绑定30-69%），白色填充框表示非竞争对（残余绑定≥70%）。IC₅₀中和抗体针对H/PF/2013菌株显示，中和克隆以蓝色突出显示。b条ZIKV E的三个原生质体（红色的DI、黄色的DII和蓝色的DIII）的带状图显示了每个竞争结合群中代表性抗体的表位映射实验中以球体突出显示的关键残基。关键残留物的颜色对应于比赛组名称，如一E-FLM和DIII-LR突变体的突变分别用黑色和银色球体表示。**c（c）**，列出了每个竞争结合组的代表性单克隆抗体，以及对结合至关重要的结构域和残基。FL，熔合回路。d日对5株ZIKV菌株进行了2株单克隆抗体中和试验。浓度（ng ml⁻¹)50%或90%的中和发生在**e（电子）**。中和数据来自至少三个独立实验，一式三份。

**图3。ZIKV-117对成年雄性和怀孕雌性小鼠的保护作用**
一，我们用2 mg抗Ifnar1 mAb治疗4-5周龄的野生型雄性小鼠，然后皮下接种10^三鼠标自适应ZIKV-Daker的FFU。在D+1或D+5上用单剂量100μg或250μg的同种对照单克隆抗体（hCHK-152）或ZIKV-117治疗小鼠(n个=两个独立实验中每组10个）。通过对数秩检验分析显著性(**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01).b条,**c（c）**,*伊夫纳1*^−/−雌性小鼠与野生型雄性交配。在E5.5时，用250μg hCHK-152同种型对照mAb或ZIKV-117处理母鼠。条形图表示中值，并反映四个独立实验的数据。用四分法分析病毒RNA对胎儿存活的意义(b条; *****P（P）*<0.0001）和曼·惠特尼(**c（c）**; **P（P）*<0.05）试验。d日–**（f）**，野生型雌性小鼠与野生型雄性交配。在E5.5时，用抗Ifnar1单克隆抗体和以下其中一种抗体治疗母鼠：PBS(d日,**e（电子）**)，250微克(d日–**（f）**)hCHK-152同型对照单克隆抗体，250μg ZIKV-117(d日–**（f）**)或250μg ZIKV-117 LALA(**（f）**). 在E6.5，母鼠接种了10个^三ZIKV-Dakar的FFU。d日–**（f）**、胎儿和胎盘(d日,**（f）**)母体大脑和血清(**e（电子）**)在E13.5上收集病毒RNA，用qRT-PCR检测病毒RNA。条形图表示从三个生物复制品中采集的样本的中值(d日,n个= 20–36;**e（电子）**,n个= 5–9;**（f）**,n个= 23–28). 采用Dunn多重比较检验，通过方差分析进行显著性分析(**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001).克,小时，野生型雌性小鼠与野生型雄性交配。在E5.5时，用抗Ifnar1单克隆抗体处理母鼠。在E6.5，母鼠接种了10个^三ZIKV-Dakar的FFU。在E7.5（感染后第1天），用PBS、250μg hCHK-152同型对照单克隆抗体或250μg ZIKV-117治疗母鼠。克,小时、胎儿和胎盘(克)母体大脑和血清(小时)在E13.5上收集病毒RNA，用qRT-PCR检测病毒RNA。条形图表示从三个生物复制品中采集的样本的中值(克,n个= 8–20;小时,n个= 3–7). 通过ANOVA和Dunn’s分析显著性(克)或Tukey的(小时)多重比较试验(**P（P）*< 0.05, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001). 虚线表示检测限。

**图4。ZIKV-117治疗对胎盘和胎儿的影响**
一，描绘小鼠胎盘结构和区域的漫画。b条–**e（电子）**，在感染ZIKV-Dakar或模拟感染前，孕妇接受PBS、hCHK-152或ZIKF-117治疗，如图3d–f所示。b条E13.5胎盘血红素和曙红染色。胎盘迷路区用实线标记。低功率（比例尺，1 mm）和高功率（比标尺，50μm）图像依次显示。黑色箭头表示ZIKV感染区域对应区域的滋养层细胞凋亡（见面板d日，见下文）。**c（c）**测量胎盘的厚度和显示面积以及胎儿的体型。每个符号代表单个胎盘或胎儿的数据。采用Dunn多重比较检验，通过方差分析进行显著性分析(**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001,*P（P）*>0.05，NS，不显著）。d日,现场杂交。低功率（标尺，500μm）和高功率（标杆，50μm）图像依次显示。黑色箭头表示胎盘结合区内的细胞ZIKV RNA阳性。面板中的图像代表了独立水坝中的几个胎盘。**e（电子）**用PBS或ZIKV-117治疗的ZIKV感染的母鼠或未感染的怀孕动物胎盘上的波形蛋白（绿色，标记胎儿毛细血管内皮）免疫荧光染色的低倍（标尺，50μm）和高倍（标杆，10μm）放大图像。细胞核是DAPI反染蓝色。

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中的注释

感染：寨卡病毒：传播结束？
博尔登·Y。博尔登·Y。国家免疫学评论。2016年11月25日；16(12):718-719. doi:10.1038/nri.2016.131。国家免疫学评论。2016 PMID：27885280 没有可用的摘要。

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1. Musso D、Nilles EJ、Cao-Lormeau VM。新出现的寨卡病毒在太平洋地区迅速传播。临床微生物感染。2014;20：O595–O596。-公共医学
1. 阿劳霍AQC、Silva MTT、阿劳霍APQC。寨卡病毒相关神经疾病：综述。大脑。2016;139:2122–2130.-公共医学
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[3] Oehler E等。寨卡病毒感染并发格林-巴利综合征——病例报告，法属波利尼西亚，2013年12月。欧洲共同体公牛。2014;19:7–9.-公共医学

[4] Oehler E等。寨卡病毒感染并发格林-巴利综合征——病例报告，法属波利尼西亚，2013年12月。欧洲共同体公牛。2014;19:7–9.-公共医学

[5] Musso D、Nilles EJ、Cao-Lormeau VM。新出现的寨卡病毒在太平洋地区迅速传播。临床微生物感染。2014;20：O595–O596。-公共医学

[6] Musso D、Nilles EJ、Cao-Lormeau VM。新出现的寨卡病毒在太平洋地区迅速传播。临床微生物感染。2014;20：O595–O596。-公共医学

[7] 阿劳霍AQC、Silva MTT、阿劳霍APQC。寨卡病毒相关神经疾病：综述。大脑。2016;139:2122–2130.-公共医学

[8] 阿劳霍AQC、Silva MTT、阿劳霍APQC。寨卡病毒相关神经疾病：综述。大脑。2016;139:2122–2130.-公共医学

[9] Gatherer D，Kohl A.Zika病毒：一种以前缓慢的流行病在美洲迅速传播。维罗尔将军。2016;97:269–273.-公共医学

[10] Gatherer D，Kohl A.Zika病毒：一种以前缓慢的流行病在美洲迅速传播。维罗尔将军。2016;97:269–273.-公共医学

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