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.2016年11月2:6:36481。
doi:10.1038/srep36481。

氧化应激下活性氧介导的小鼠角膜上皮前体细胞不同稳态

附属公司

氧化应激下活性氧介导的小鼠角膜上皮前体细胞不同稳态

荆州等。 科学代表. .

摘要

活性氧在干细胞生物学中的作用尚未得到充分的说明和理解。在这里,我们比较了不同的反应,并研究了过氧化氢(H2O(运行)2)在小鼠角膜上皮前体细胞系(TKE2)和成熟的小鼠角膜上皮细胞(MCE)之间。TKE2表现出不同的体内平衡和对H的强烈抵抗2O(运行)2TKE2降低了活性氧的生成,抑制了活性氧生成酶NADPH氧化酶4(NOX4),并增加了双特异性磷酸酶6(DUSP6)。此外,TKE2激活核因子(红细胞衍生2)样2(NRF2)信号通路,调节miR-125B1和miR-29B1,并提高抗氧化剂谷胱甘肽S-转移酶P(GSTP)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。RNA干扰方法和药理拮抗也证实了与细胞活性氧的关联。此外,TKE2增强了H暴露后的自噬2O(运行)2新的证据表明,TKE2细胞通过调节ROS的形成和途径,对氧化应激具有不同的稳态和强大的抗氧化特性。

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数字

图1
图1。活性氧对H诱导的氧化应激的不同反应2O(运行)2.
(A类)TKE2和MCE的细胞活力。(B类)荧光DCF法检测ROS生成。TKE2中的DCF荧光强度。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 3)(C)MCE中的DCF荧光强度。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 3)(D)TKE2(上面板)和MCE(下面板)ROS标记物3-NT免疫细胞化学染色的代表性图像。(比例尺:80微米)(E)TKE2中3-NT的典型图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 3)(F)MCE中3-NT的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05. (n个 = 3)(G)用SOD测定试剂盒测定SOD活性。TKE2的SOD活性。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 3)(H)MCE的SOD活性。数据表示平均值±扫描电镜***P(P) < 0.001. (n个 = 3).
图2
图2。H诱导NOX4的变化2O(运行)2.
(A)TKE2中NOX4表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05. (n个 = 3)(B)TKE2中NOX4的典型图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01. (n个 = 5)(C)MCE中NOX4表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01 (n个 = 5).(D)MCE中NOX4的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01(n个 = 7).(E)NOX4在TKE2(上面板)和MCE(下面板)中的免疫细胞化学染色的代表性图像。(比例尺:80微米)。(F)TKE2中DUSP6的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01. (n个 = 5)(G)MCE中DUSP6的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜***P(P) < 0.001. (n个 = 4) 。
图3
图3。H诱导NRF2信号通路的激活2O(运行)2.
(A)TKE2中NRF2表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01. (n个 = 4)(B)TKE2中NRF2的代表性图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01. (n个 = 8)(C)MCE中NRF2表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 3)(D)MCE中NRF2的典型图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001. (n个 = 3).(E)NRF2在TKE2(上面板)和MCE(下面板)中的免疫细胞化学染色代表性图像(比例尺:80微米)。(F)TKE2中miR-125B1和miR-29B1的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01. (n个 = 3)(G)MCE中miR-125B1和miR-29B1的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 3–4)(H)TKE2中GSTP表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05. (n个 = 3)(I)TKE2中GSTP的典型图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01. (n个 = 4)(J)MCE中GSTP表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 4)(K)MCE中GSTP的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05 (n个 = 4) 。
图4
图4。RNA干扰和药理拮抗。
(A)NOX4 siRNA转染后MCE中NOX4表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05. (n个 = 3)(B)NOX4 siRNA转染后MCE中NOX4的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01, ***P(P) < 0.001(n个 = 4) 。(C)NOX4激动剂TPA治疗后TKE2中NOX4表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001. (n个 = 5)(D)TPA治疗后TKE2中NOX4的典型图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 4)(E)NRF2激动剂SFN治疗后MCE中NRF2表达的qRT-PCR。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001. (n个 = 3)(F)SFN治疗后MCE中NOX4的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01, ***P(P) < 0.001. (n个 = 4) 。
图5
图5。自噬标记物的改变。
(A)TKE2中P62蛋白的典型图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001.(n个 = 6)(B)MCE中P62蛋白的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01. (n个 = 4)(C)TKE2中Beclin1蛋白的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05. (n个 = 3)(D)MCE中Beclin1的典型图像和western blot分析。数据表示平均值±扫描电镜**P(P) < 0.01. (n个 = 5)(E)TKE2中LC3-II和LC3-I比率的代表性图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05. (n个 = 5)(F)MCE中LC3-II和LC3-I比率的典型图像和western blot分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05(n个 = 3).
图6
图6。TKE2分化状态的比较。
(A)定量RT-PCR分析TKE2和分化的TKE2之间ABCG2、P63和K14的表达。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001. (ABCG2:n个 = 4; 第63页:n个 = 4; K14:n个 = 4)(B)分化型TKE2中NOX4的典型图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,并且图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05. (n个 = 5)(C)分化TKE2中NRF2的代表性图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001. (n个 = 6)(D)分化TKE2中GSTP的典型图像和蛋白质印迹分析。在相同的实验条件下进行印迹,图像来自相同的凝胶。数据表示平均值±扫描电镜*P(P) < 0.05, ***P(P) < 0.001. (n个 = 8) 。

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引用人

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