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.2016年12月9日；291(50):25983-25998.
doi:10.1074/jbc。M116.745596。 Epub 2016年10月28日。

雄激素受体辅酶ELK1蛋白细胞外信号调节激酶（ERK）对接位点的氨基末端结构域诱导支持前列腺癌细胞生长的持续基因激活

雷娜·罗萨蒂 1 2, 穆格达·帕奇 1 2, 文卡特斯·查里 1, Selvakumar Dakshnamurthy公司 1, 托马斯·麦克福尔 1 2, 贾妮斯·萨克斯顿 三, 本杰明·基德 1 2, 彼得·E·肖 三, 马诺哈尔·拉特南 4 2
附属公司

雄激素受体辅酶ELK1蛋白细胞外信号调节激酶（ERK）对接位点的氨基末端结构域诱导支持前列腺癌细胞生长的持续基因激活

雷娜·罗萨蒂等。 生物化学杂志. .

摘要

ETS域转录因子ELK1与生长基因呈抑制性关联，通过ERK1/2磷酸化瞬时激活。在前列腺癌（PCa）细胞中，雄激素受体（AR）通过其氨基末端结构域（A/B）被ELK1招募为转录共激活物，而不发生ELK1超磷酸化。在此，我们阐明了AR与ELK1相互作用的结构基础。利用哺乳动物双杂交系统对AR协同激活ELK1所需的ELK1多肽基序与ERK激活ELK1s所需的多肽基序进行了系统定位，并通过联合免疫沉淀分析进行了确认。该映射精确地确定了ELK1中的两个ERK对接位点，即D-box和DEF（ERK对接部位，FXFP）基序，作为其与AR（A/B）或WTAR合作的基本基序。相反，ELK1中的反式激活结构域仅是ERK激活所必需的。在没有ELK1结合伴侣、ERK1/2和血清反应因子的情况下，ELK1介导的AR（A/B）的转录活性是最佳的。分离常数为1.9×10的纯化ELK1和AR结合-8m D盒和DEF基序被破坏的纯化突变体ELK1没有结合AR。D盒区域缺失的ELK1突变体对MEK抑制不敏感的PCa细胞的雄激素依赖性生长具有显性负效应。这种新的机制是，核受体通过协同蛋白激酶对接位点来共同激活生长基因，从而影响信号通路，这将有助于合理设计一类新的靶向药物干预措施。

关键词：ETS转录因子家族；雄激素受体；细胞外信号调节激酶（ERK）；前列腺癌；转录。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
AR的A/B域对于AR与ELK1的功能交互的充分性。 A类显示了AR中功能域的组织示意图。a/B域是氨基末端域(NTD公司)，包含配体依赖激活功能AF1和AF5。C结构域包括DNA结合结构域(数据库数据库)与铰链区域相邻(D类). E结构域包含配体结合结构域(劳埃德船级社)和配体依赖性激活功能AF2。F结构域代表羧基末端结构域。B类和C类，用ELK1驱动的最小启动子荧光素酶报告子转染激素缺失的HeLa细胞((ELK1型)2-TATA-LUC公司) (B类)或使用雄激素应答元件驱动的最小启动子荧光素酶报告子（ARE-TATA-Luc）(C类)并与AR A/B结构域、全长AR或质粒载体对照的表达质粒共转染。用睾酮（10 n）处理细胞米)或转染时的载体。转染48小时后测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。D类显示了用全长AR或AR a/B结构域表达质粒转染的细胞裂解物的Western blot，并用睾酮（10 n）处理米)或载体48小时，并使用AR氨基末端结构域抗体或GAPDH抗体（负载控制）进行探测。E、，用R1881（1 n）处理激素缺失的LNCaP细胞米)或载体48h。细胞总RNA用于量化已知受AR激活的ELK1依赖或ARE依赖的指示基因的mRNA水平。F、，使用表达AR A/B结构域或对照慢病毒的慢病毒转导的激素缺失型LNCaP细胞。感染72小时后收集细胞。细胞总RNA用于量化已知受AR激活的ELK1依赖或ARE依赖的指示基因的mRNA水平插入显示了使用AR氨基末端结构域抗体或GAPDH抗体（负载控制）通过Western blotting探测的细胞裂解物。G、，使用表达AR A/B结构域或对照慢病毒的慢病毒转导的激素缺失型LNCaP细胞。72小时后，将细胞置于96个平板中，并通过MTT分析监测细胞生长。用R1881（1 n）处理载体控制细胞米)或电镀后24小时内装车。这个插入显示了感染后72小时，使用AR氨基末端结构域抗体或GAPDH抗体（负荷控制）对细胞裂解物进行的Western blotting分析。对于所有转染雷尼利亚以荧光素酶报告子作为转染效率的对照。在所有面板中误差线表示实验三等分的标准偏差。*，第页< 0.001.
图2。
图2。
通过氨基末端缺失分析绘制AR（A/B）协同激活所需的ELK1多肽片段。 A类显示了使用稳定转染含有上游Gal4元素的最小启动子荧光素酶报告子产生的重组HeLa细胞获得的数据(GAL4-塔塔-LUC)以及一个表达AR a/B域与VP16反式激活域融合的向量。用表达ELK1 Gal4融合蛋白的质粒转染细胞。融合构建物用Gal4 DNA结合域（Gal4-DBD）取代ELK1的ETS DNA结合域。在这个融合结构中，进行了一系列氨基末端缺失，如A类在转染各种Gal4-ELK1融合构建物48小时后，通过制备裂解物收集细胞，以测量荧光素酶活性。启动子活性显示在年axis需要AR A/B结构域的存在，因为敲低转染全长Gal4-ELK1的相同细胞中AR（A/B）的表达会将启动子活性降低到图中显示的Gal4-DBD单独的基础值。这个插入显示了用Gal4或GAPDH抗体（负载控制）通过Western blotting探测的细胞裂解物。B类显示了仅通过稳定转染产生的重组HeLa细胞获得的数据GAL4-塔塔-LUC用Gal4-ELK1融合构建物转染细胞A类并与MEK1的组成型活性突变体的表达质粒或与载体对照共转染。在用各种Gal4-ELK1融合构建物转染48小时后，通过制备裂解物收集细胞以测量荧光素酶活性。这个插入显示了用Gal4或GAPDH抗体（负载控制）通过Western blotting探测的细胞裂解物。C类显示了ELK1的域组织示意图；这里，包含与AR（A/B）结合所需残基的ELK1多肽片段的氨基末端缺失映射（数据来自A类)由表示灰色阴影对于所有转染雷尼利亚以荧光素酶报告子作为转染效率的对照。在所有面板中误差线表示实验三倍的标准偏差。*，第页< 0.001.
图3。
图3。
通过羧基末端缺失分析绘制AR（A/B）协同激活所需的ELK1多肽片段。 A类显示了使用稳定转染含有上游Gal4元素的最小启动子荧光素酶报告子产生的重组HeLa细胞获得的数据(GAL4-塔塔-LUC)并且还与表达与VP16反式激活结构域融合的AR a/B结构域的载体结合。用表达ELK1 Gal4融合蛋白的质粒转染细胞。融合构建物取代了Gal4 DNA结合域(Gal4-DBD合金)用于ELK1的ETS DNA结合结构域。在这个融合结构中，进行了一系列羧基末端缺失，如A类用不同的Gal4-ELK1融合构建物转染48小时后，通过制备裂解物收集细胞，以测量荧光素酶活性。启动子活性显示在年axis需要AR A/B结构域的存在，因为敲低转染全长Gal4-ELK1的相同细胞中AR（A/B）的表达会将启动子活性降低到图中显示的Gal4-DBD单独的基础值。这个插入显示了用Gal4或GAPDH抗体（负载控制）通过Western blotting探测的细胞裂解物。B类显示了仅通过稳定转染产生的重组HeLa细胞获得的数据GAL4-塔塔-LUC用Gal4-ELK1融合构建物转染细胞A类并与MEK1组成活性突变体的表达质粒或与载体对照共转染。在用各种Gal4-ELK1融合构建物转染48小时后，通过制备裂解物收集细胞以测量荧光素酶活性。这个插入显示了用Gal4或GAPDH抗体（负载控制）通过Western blotting探测的细胞裂解物。C类显示了ELK1的域组织示意图；这里，包含与AR（A/B）结合所需残基的ELK1多肽片段的羧基末端缺失映射（数据来自A类)由表示灰色阴影对于所有转染雷尼利亚以荧光素酶报告子作为转染效率的对照。在所有面板中误差线表示实验三倍的标准偏差。*，第页< 0.001.
图4。
图4。
通过内部缺失分析绘制AR（A/B）共同激活所需的ELK1多肽片段。 A类显示了使用稳定转染含有上游Gal4元素的最小启动子荧光素酶报告子产生的重组HeLa细胞获得的数据(GAL4-塔塔-LUC)以及一个表达AR a/B域与VP16反式激活域融合的向量。用表达ELK1 Gal4融合蛋白的质粒转染细胞。融合构建物取代了Gal4 DNA结合域(Gal4-DBD合金)ELK1的ETS DNA结合域。在这个融合构造中，进行了一系列内部删除，如A类用不同的Gal4-ELK1融合构建物转染48小时后，通过制备裂解物收集细胞，以测量荧光素酶活性。启动子活性显示在年轴需要AR A/B结构域的存在，因为在用全长Gal4-ELK1转染的相同细胞中敲低AR（A/B）表达将启动子活性降低到图中所示的单独Gal4-DBD的基础值。这个插入显示了用Gal4或GAPDH抗体（负载控制）通过Western blotting探测的细胞裂解物。B类显示了仅通过稳定转染产生的重组HeLa细胞获得的数据GAL4-塔塔-LUC用用于A类并与MEK1组成活性突变体的表达质粒或与载体对照共转染。在用各种Gal4-ELK1融合构建物转染48小时后，通过制备裂解物收集细胞以测量荧光素酶活性。这个插入显示了用Gal4或GAPDH抗体（负载控制）通过Western blotting探测的细胞裂解物。C类显示了ELK1的域组织示意图；这里，包含与AR（A/B）结合所需残基的两个ELK1多肽片段的缺失映射（数据来自图3A类, 4A、，和5A类)由表示灰色阴影这两个部分。对于所有转染雷尼利亚以荧光素酶报告子作为转染效率的对照。在所有面板中误差线表示实验三倍的标准偏差。*，第页< 0.001.
图5。
图5。
AR共同激活所需的ELK1基序的映射的进一步细化（A/B）。 A类显示ELK1多肽序列。这个带括号的片段表示从图3-5中的缺失分析中映射的两个片段，它们是包含ELK1与AR（A/B）关联所必需残基的区域。这个装箱的段表示ELK1和F的D域X（X）ELK1的FP图案。中的段粗体字体表示为进一步映射而删除的肽B类和C.B公司和D类显示通过稳定转染含有上游Gal4元件的最小启动子荧光素酶报告子产生的重组HeLa细胞获得的数据(GAL4-塔塔-LUC)以及一个表达AR a/B域与VP16反式激活域融合的向量。用表达ELK1 Gal4融合蛋白的质粒转染细胞。融合构建物取代了Gal4 DNA结合域(Gal4-DBD合金)用于ELK1的ETS DNA结合结构域。在这个融合结构中，如B类和D类用不同的Gal4-ELK1融合构建物转染48小时后，通过制备裂解物收集细胞，以测量荧光素酶活性。启动子活性显示在年轴需要AR A/B结构域的存在，因为在用全长Gal4-ELK1转染的相同细胞中敲低AR（A/B）表达将启动子活性降低到图中所示的单独Gal4-DBD的基础值。这个插入在里面B类和D类显示通过Western blotting用Gal4或GAPDH抗体检测到的细胞裂解物（负荷控制）。C类和E类显示仅通过稳定转染产生的重组HeLa细胞获得的数据GAL4-塔塔-LUC用Gal4-ELK1融合构建物转染细胞B类和D类分别与MEK1组成活性突变体的表达质粒或与载体对照共转染。在用各种Gal4-ELK1融合构建物转染48小时后，通过制备裂解物收集细胞以测量荧光素酶活性。这个插入在里面C类和E类显示通过Western blotting用Gal4或GAPDH抗体检测到的细胞裂解物（负荷控制）。对于所有转染雷尼利亚以荧光素酶报告子作为转染效率的对照。在所有面板中误差线表示实验三倍的标准偏差。*，第页< 0.001.
图6。
图6。
全长AR共同激活所需的ELK1基序。 A类显示了使用重组HeLa细胞获得的数据，所述重组HeLa细胞通过稳定转导含有上游Gal4元件的最小启动子萤光素酶报告子而产生(GAL4-塔塔-LUC). 将细胞置于激素缺失培养基中，并与所示Gal4-ELK1融合蛋白的表达质粒和全长AR的表达质粒共同转染。融合构建物用Gal4-DNA结合域（Gal4-DBD）取代ELK1的ETS DNA结合域。转染时，用睾酮（10 n）处理细胞米)或车辆控制。转染48小时后，通过制备裂解物收集细胞，以测量荧光素酶活性。B类显示了用Gal4、AR或GAPDH抗体（负载控制）通过Western blotting探测的细胞裂解物。C类显示了来自HeLa细胞裂解物的异位AR和异位ELK1或ELK1突变体的联合免疫沉淀数据。用AR表达质粒转染HeLa细胞，并与WTELK1表达质粒或两个ELK1突变体之一ELK1Δ308-321和ELK1 FxLa共转染。裂解物被免疫沉淀(IP（IP）)使用AR抗体或阴性对照。如图所示，使用AR或ELK1抗体通过Western blotting检测免疫沉淀物。*，第页< 0.01.
图7。
图7。
耗尽SRF或ERK1/2对AR与ELK1相互作用的影响。 A类和B类显示通过稳定转染含有上游Gal4元件的最小启动子荧光素酶报告子产生的重组HeLa细胞获得的数据(GAL4-塔塔-LUC)以及表达AR的载体和Gal4-ELK1融合构建体，其中Gal4-DNA结合结构域被ELK1的ETS DNA结合结构域取代。这些细胞被耗尽激素，然后用抗SRF的shRNA或使用慢病毒的非靶向对照shRNA转导。感染72小时后，用睾酮（10 n）处理细胞米)或载体再放置48小时。然后收集细胞以量化SRF mRNA(A类)或用于使用针对SRF或针对GAPDH的抗体的蛋白质印迹分析（负载对照）(A、 插入)或荧光素酶活性(B类).C类和D类显示通过稳定转染产生的重组HeLa细胞获得的数据GAL4-塔塔-LUC以及表达AR a/B域与VP16事务激活域（AR（a/B）-VP16）融合的向量。用抗SRF的shRNA或使用慢病毒的非靶向对照shRNA转导细胞。感染72小时后，用Gal4-ELK1融合蛋白表达质粒转染细胞。48小时后，收集细胞以量化SRF mRNA(C类)或使用SRF或GAPDH抗体进行免疫印迹分析（负荷控制）(C、 插入)或测量荧光素酶活性(D类).E–G公司显示使用稳定掺入的重组HeLa细胞获得的数据GAL4-塔塔-LUC并稳定表达AR（A/B）-VP16融合蛋白。用抗ERK1和ERK2的siRNA混合物或对照非靶向siRNA转染细胞。转染48小时后，收集细胞以量化ERK1或ERK2 mRNA(E类)或使用ERK1/2或GAPDH抗体进行Western blotting分析（负荷控制）(E、 低于); 将剩下的细胞再次转染Gal-4ELK1表达质粒或控制载体质粒或MEK1组成活性突变体质粒(F类). 再过24小时，收集细胞以量化ERK1和ERK2的mRNA(E类)或使用ERK1/2或GAPDH抗体进行Western blotting分析（负荷控制）(E、 低于)或测量荧光素酶活性(F类).H、，用ELK1驱动的最小启动子荧光素酶报告子联合转染HeLa细胞((ELK1型)2-TATA-LUC公司)AR（A/B）或组成活性MEK1或对照载体质粒的表达质粒。用曲美替尼（1μ米)或载体转染48小时。在细胞裂解液中测定荧光素酶活性。对于所有转染雷尼利亚以荧光素酶报告子作为转染效率的对照。在所有面板中误差线表示实验三倍的标准偏差。*，第页<0.001；**，第页< 0.001.
图8。
图8。
ELK1和AR的直接结合以及ELK1对接位点的破坏对AR结合和雄激素依赖性细胞生长的影响。 A类显示纯化的His标记的ELK1蛋白和突变的His标记的ELK1蛋白的SDS-PAGE(ELK1单位)在D盒（Δ308–321）和DEF图案中。考马斯蓝染色显示蛋白质带，估计纯度>85%，用于以下SPR实验以及商业上获得的纯化AR。B类显示了定量分析AR与His标记ELK1结合的SPR动力学曲线。AR固定在CM5传感器芯片上，ELK1被稀释成一系列浓度（0、5、10、20、40、80和160 n米). 通过减去SPR响应将结果归一化(俄罗斯)仅用于缓冲区或BSA，并重复执行。C类显示了定量分析AR与His标记突变体ELK1结合的SPR动力学曲线。AR被固定，如B、，在100 n时使用ELK1或突变ELK1米.显示了三次测定的动力学曲线。D、，使用表达WTELK1或ELK1（Δ308–321）的慢病毒或对照慢病毒转导激素缺失的LNCaP细胞。72小时后，将细胞接种在96孔板中，并通过MTT法监测细胞生长。电镀24小时后，用R1881（1 n）处理细胞米)或车辆再行驶72小时插入在里面D类显示了感染后72小时，使用ELK1抗体或GAPDH抗体（负荷控制）对细胞裂解物进行的Western blotting分析。这个误差线表示实验三等分的标准偏差。*，第页< 0.001.E、，在R1881（1 n米)与车辆、曲美替尼（1μ米)或AKTi-1/2（2μ米). 72小时后进行MTT分析。这个误差线表示实验三倍的标准偏差。*，第页< 0.001.
图9。
图9。
ELK1和AR-V7的功能关联及其对细胞生长的影响。 A、，用ELK1驱动的最小启动子荧光素酶报告子联合转染HeLa细胞((ELK1型)2-塔塔卢克)以及AR-V7或WTELK1的表达质粒或48h的对照载体质粒。在细胞裂解液中测量荧光素酶活性。对于所有转染雷尼利亚以荧光素酶报告子作为转染效率的对照。B、，用Gal4-driven minimal promotor luciferase reporter（Gal4-TATA-Luc）和AR-V7或Gal4-ELK1或对照载体质粒的表达质粒共同转染HeLa细胞48小时。在细胞裂解液中测量荧光素酶活性。对于所有转染雷尼利亚以荧光素酶报告子作为转染效率的对照。C类显示HeLa细胞裂解物的Western blot，对应于A类和B、，其使用AR的氨基末端结构域的抗体或GAPDH的抗体（负载对照）进行探测。D、 顶部面板与对照shRNA相比，MTT试验显示慢病毒shRNA转导耗尽ELK1对CWR22Rv1细胞生长的影响底部面板显示与对照shRNA相比，ELK1 shRNA诱导的ELK1耗竭；探讨GAPDH作为负荷控制。
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