Derivation of Corneal Keratocyte-Like Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

doi:10.1371/journal.pone.0165464

.2016年10月28日；11（10）：e0165464。

doi:10.1371/journal.pone.0165464。 2016年eCollection。

人诱导多能干细胞衍生角膜角质细胞样细胞

理查德·奈勒¹, 查尔斯·N·J·麦基¹, 乍得A Cowan², 艾伦·J·戴维森^三, 特蕾莎·M·霍尔姆², 特雷弗·舍温¹

附属公司

¹新西兰奥克兰1142奥克兰大学眼科。
²哈佛干细胞研究所，哈佛大学，马萨诸塞州剑桥02138，美利坚合众国。
^三新西兰奥克兰1142奥克兰大学分子医学和病理学系。

PMID： 27792791
预防性维修识别码：项目经理5085044
内政部： 10.1371/journal.pone.0165464

人诱导多能干细胞衍生角膜角质细胞样细胞

理查德·奈勒等。公共科学图书馆一号. 2016.

.2016年10月28日；11（10）：e0165644。

doi:10.1371/journal.pone.0165464。 2016年eCollection。

作者

理查德·奈勒¹, 查尔斯·N·J·麦基¹, 乍得A Cowan², 艾伦·J·戴维森^三, 特蕾莎·霍尔姆², 特雷弗·舍温¹

附属公司

¹新西兰奥克兰1142奥克兰大学眼科。
²哈佛干细胞研究所，哈佛大学，马萨诸塞州剑桥02138，美利坚合众国。
^三新西兰奥克兰1142奥克兰大学分子医学和病理学系。

PMID： 27792791
预防性维修识别码：项目经理5085044
内政部： 10.1371/journal.pone.0165464

摘要

圆锥角膜等角膜疾病是人类中相对常见的疾病。然而，治疗仅限于角膜移植，这只发生在最严重的病例中。基于细胞的治疗可能提供一种替代方法，因为眼睛容易接受这种治疗，而圆锥角膜等角膜疾病与角膜角膜细胞的死亡有着特殊的联系。体外生成角膜基质细胞的能力可能使细胞治疗圆锥角膜患者成为可能。人类诱导多能干细胞（hiPSCs）提供了丰富的细胞来源，人体内的任何细胞都可以从中获得。在本研究中，hiPSCs成功分化为神经嵴细胞（NCCs），即角膜细胞的胚胎前体细胞，然后在尸体角膜组织上培养以促进角膜细胞分化。发现hiPSC衍生的NCC迁移到角膜基质中，在那里它们获得了类似于角膜细胞的角膜细胞样形态和表达模式，类似于体内的角膜角膜细胞。这些结果表明，hiPSCs可用于体外生成角膜基质细胞，并为将这些细胞用于角膜细胞治疗奠定了基础。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。从人诱导多能干细胞（hiPSCs）中生成神经嵴细胞（NCCs）。**
（A）在神经嵴细胞（NCCs）衍生的12天方案的第0天观察到hiPSC菌落。第9天，细胞外观更为间充质，具有典型的NCC样树突状形态。（B）（C）我们观察到hiPSC是SOX2⁺，但hiPSC衍生的NCC是SOX2^->80%的衍生NCC对神经嵴标记物AP2a和p27呈阳性^NTR公司.亮场比例尺代表200μm，低倍（10X）共焦图像比例尺表示100μm，高倍（63X）共聚图像比例栏代表10μm。

**图2。衍生NCCs与hiPSCs的表达分析。**
定量聚合酶链反应（qPCR）分析显示，与hiPSC相比，衍生的NCC具有更多的神经嵴标记物表达。多能性标记*SOX2标准*,*10月3日/4日*和纳米净现金流量显著减少，但*KLF4型*表达维持在类似水平。

**图3。3D培养促进角膜角质细胞样细胞的命运。**
（A）面板显示hiPSC衍生的NCC染有HNK1、Vimentin、AP2a、角质形成素（显示为红色，因为它与AP2a面板共染）和ABCB5。（B）如图顶部的示意图所示，生成了3D培养物。面板显示了3D培养NCC的横向冰冻切片，这些NCC染色了HNK1、Vimentin、AP2a、Keratocan（红色）和ABCB5。角砾岩中的箭头⁺面板显示角质形成素的细胞外沉积。比例尺代表100μm。

**图4。三维培养NCC与非三维培养NCCs和尸体人类角膜基质细胞的表达分析。**
（A） qPCR分析显示，3D培养的衍生NCC的许多神经嵴标记物的表达水平较低，例如*PAX3系列*,*SOX10标准*,*CX32系列*,*FOXD3系列*和*MSX1系列*与非3D培养的NCC相比。3D培养上调角膜基质细胞中高表达的基因。（B） 3D培养的NCC的基因表达谱与尸体角膜基质细胞基本不兼容。在比较两个群体时，所检测的大多数基因的基因表达水平显著高于或低于。

**图5。植入角膜缘缘的hiPSC衍生的NCC迁移至角膜，然后迁移至基质。**
（A）如示意图所示，将hiPSC衍生的NCC接种到角膜缘片的巩膜区。（B） 4天后，Calcein AM活细胞染色显示所有衍生的NCC都已迁移到角膜缘片的角膜表面区域。到第7天，7个衍生的NCC已经迁移到角膜基质中。低倍率图像的比例尺（左手侧）代表200μm，高倍率图像（右手侧）代表100μm。

**图6。边缘种植的NCC具有角膜角质细胞样的命运，并在胶原板层之间迁移。**
（A）对照组未喂食边缘冷冻切片显示无DAPI⁺细胞核或AP2a⁺/角砾岩⁺细胞。接种衍生NCC的边缘轮辋确实含有AP2a⁺/角质层⁺培养21天后的细胞（箭头）。（B）高倍图像显示角质形成⁺衍生的NCCs在角膜基质层的胶原片层内迁移（该图是（a）中所示的角膜基质染色的更高放大倍数。澳大利亚广播公司5⁺，波形蛋白⁺和HNK1⁺在这些细胞中也检测到染色。（A）中的比例尺代表100μm，（B）中的标尺代表50μm。

**图7。表达分析显示，植入角膜缘缘的NCC采用与人类角膜基质细胞相似的表达模式。**
qPCR分析表明，在角膜缘片（蓝条）上培养的hiPSC衍生NCC的表达谱与在3D培养物（红条）中培养的hiPS衍生NCC更类似于人类角膜基质细胞。重要的是，当衍生的NCC在角膜缘切片上培养时，许多角膜细胞标记物的表达要高得多，例如*ALDH3A1型*,*科拉托坎*,*PtGDS公司*和*AQP1类*.

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作者获得了哈登·汤姆·猫信托基金会（Hadden Tom Cat Trust Post-Doctoral Fellowship），该基金由医学院基金会（赠款编号9113/370-4211）持有。

[1] Komai Y，Ushiki T.人类角膜和巩膜中胶原纤维的三维组织。投资眼科视觉科学。1991;32(8):2244–58. Epub 1991年7月1日。-公共医学

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