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.2016年12月1日；129(23):4341-4353.
doi:10.1242/jcs.193904。 Epub 2016年10月27日。

Rab40b-Tks5复合物在入侵足形成和癌细胞侵袭中的作用和调控

阿比莎·雅各布 1, 埃里克·林克莱特 1, 布莱恩·贝利斯 1, 特蕾西·莱昂斯 2, Rytis Prekeris公司 三
附属公司

Rab40b-Tks5复合物在入侵足形成和癌细胞侵袭中的作用和调控

阿比莎·雅各布等。 细胞科学杂志. .

摘要

侵入体的形成和细胞外基质的降解是癌细胞侵袭过程中的关键事件，但对介导这些过程的机制知之甚少。在这里，我们报道了Rab40b在乳腺癌细胞侵袭过程中介导侵袭因子功能的关键作用。我们还将已知的Src激酶底物Tks5（也称为SH3PXD2A）鉴定为一种新的Rab40b效应蛋白，并表明Tks5作为一个系链，介导含有MMP2和MMP9的运输囊泡依赖Rab40b-靶向延伸的入侵足类。重要的是，我们还证明Rab40b和Tks5水平由已知的肿瘤抑制因子microRNA miR-204调节。这是首次研究发现一种新的Rab40b-Tks5-和miR-204-依赖的侵袭性多巴胺转运途径，该途径在癌症进展过程中调节MMP2和MMP9的分泌以及细胞外基质重塑。

关键词：侵略者；MMP2；MMP9；转移；Rab40b；5塔卡。

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作者声明没有竞争或财务利益。

数字

图1。
图1。
Rab40b定位于入侵虫并调节癌细胞侵袭。（A） 对照组MDA-MB-231细胞或稳定表达Rab40b shRNAs（KD1或KD2）的MDA-MB231细胞，放置在含有明胶塞的跨孔过滤器上，并允许其向生长因子富集梯度侵入5 天。作为阳性对照，一组野生型MDA-MB-231细胞也用SB3CT（MMP2和MMP9抑制剂）处理。细胞用钙化蛋白染色，并以10-µm的步长成像，以测量侵袭距离。下面显示的数据是三个独立实验的平均值±标准差。对于每个数据点，统计15个随机选择字段中的单元格*P（P）<0.005，对照数据点与经SB3CT处理或表达Rab40b shRNA的细胞（双尾Student’st吨-测试）。将稳定表达FLAG–Rab40b的（B，E，F）MDA-MB-231细胞与Matrigel和I型胶原混合，嵌入3D室载玻片上并培养48小时 h（B）和72 h（E，F）。用抗微管蛋白和抗FLAG抗体对球体进行染色。将（C，D）MDA-MB-231细胞嵌入Matrigel、I型胶原和DQ明胶混合物中，培养48小时 h.箭头表示正在形成入侵。
图2。
图2。
Rab40b是入侵昆虫延伸和成熟所必需的。将野生型（A，B）或稳定表达Rab40b shRNA（KD1或KD2；C，D）的（A–D）MDA-MB-231细胞嵌入Matrigel+胶原蛋白I混合物中，并生长4小时 天。然后将球状体固定，并用抗微管蛋白（绿色）和卵磷脂（红色）抗体染色，以标记成熟的入侵虫。在B中，野生型球体用50 最后48天的MMP2和MMP9抑制剂（Inh.）SB3CT的µM 第h页，共4页 日增长。A和D中的箭头表示入侵。分析每组细胞的（E，F）侵入体长度（F）和带有侵入体的球体数量（E）。所示数据为三个独立实验的平均值±标准差。n个是所分析的球体总数。P（P）-将给出的值与对照值进行比较，并使用双尾Student’st吨-测试。
图3。
图3。
Rab40b敲除影响血管生成、原发性肿瘤生长和转移体内.（A） 在无毛SCID小鼠的乳腺脂肪垫内注射野生型MDA-MB-231（Wt）、shRNA对照（control）和Rab40b敲除（KD1或KD2）细胞。处死小鼠并测量肿瘤体积8 注射后数周。每个细胞系类型分析10–25只小鼠。星号（*）标记因肿瘤大小超过指导值和溃疡而必须在第7周处死的小鼠。所示数据为平均值±标准差。n个是测量的肿瘤总数。（B） 将野生型（Wt）和Rab40b KD（KD1或KD2）细胞植入无毛SCID小鼠的乳腺脂肪垫。每个细胞系类型分析10–25只小鼠。每周测量肿瘤体积，并使其生长至最终肿瘤负荷2 厘米三所示数据为平均值±标准差。n个是所分析的肿瘤总数。（C） 分离的肿瘤8 对照组（野生型）和Rab40b KD1小鼠注射后第周进行免疫组织化学分析。用抗CD31抗体对肿瘤标本进行染色，检测血管面积。对每个肿瘤在三个单独的切片中随机选择的15个区域进行分析。所示数据为三种不同对照和三种不同KD1肿瘤的平均±标准差。图像中的箭头指向单个CD31阳性血管。注意对照组和KD1原发性肿瘤血管大小的差异。（D） 肺脏分离8 对照组和KD1小鼠注射后第周进行双色FISH分析。每个肿瘤组分析三个肺。从每个肺的五个不同部分随机选择15个区域进行分析。散点图显示每个肺段的平均转移数，并显示平均值±标准差。由人类细胞组成的转移性病变显示为红色团块，在绿色小鼠细胞和蓝色DAPI染色的海洋中用白色箭头标记。每个图像都代表了整个肿瘤组。P（P）-将给定的值与对照进行比较，并使用双尾Student’s进行计算t吨-测试。
图4。
图4。
Rab40b结合Tks5 PX结构域。（A） 裂解稳定表达FLAG–Rab40b的MDA-MB-231细胞，并在不存在或存在GTPγS的情况下培养裂解产物。FLAG–然后使用抗FLAG抗体免疫沉淀Rab40b，并使用抗Tks5抗体免疫印迹。纯化的非特异性小鼠IgG用作免疫沉淀实验的对照。（B） 用各种GST标记的Tks5片段进行谷胱甘肽珠下拉试验。（C） GST–Tks5-PX（GST-PX）包衣谷胱甘肽珠与MDA-MB-231裂解物在存在或不存在GTPγS的情况下孵育。然后用抗FLAG抗体进行免疫印迹分析结合FLAG–Rab40b的量。（D） 用各种Tks5-PX突变体进行谷胱甘肽珠下拉试验。（E–G）描述PX域内残基位置和疏水相互作用的PX域结构模型。E和G从不同侧面显示PX结构域；F显示了包含23-YVUI-28图案的E的放大视图。星号突出显示了Rab40b绑定所需的Tyr24。（H） Y27A和Y24A突变对GST–PX结合FLAG–Rab40b能力的影响。所示数据为三个独立实验得出的平均值±标准差。
图5。
图5。
miR-204调节乳腺癌细胞中Rab40b的水平。（A） Rab40b-3′UTR包含一个推测的miR-204种子区。将野生型和突变的Rab40b-3′UTR克隆到psiCheck2双荧光素酶报告载体中，并与miR-204模拟物或阴性对照物共同转染细胞。空psiCheck2质粒也用作阴性对照。的活动雷尼利亚和萤火虫荧光素酶分析24 转染后h。这些数据表示雷尼利亚：萤火虫活动与对照组相比。所示数据为三个独立实验的平均值±标准差。两个突变体的详细信息见图S4D（B）细胞模拟处理（无模拟）或用阴性对照或50 nM miR-204模拟物用于72 h.然后采集细胞，通过qPCR分析Rab40b mRNA水平。所示数据为3个独立实验的平均值±标准差。（C，D）用阴性对照或miR-204模拟物处理的未经处理的MDA-MB-231细胞（对照或模拟）MDA-MB-231细胞被镀在涂有明胶的盖玻片上，明胶补充有HiLyte-Fluro-488标记的纤维连接蛋白。72岁之后 培养h后，固定细胞并用罗丹明-鬼笔肽染色。黑点标记了入侵依赖性ECM退化的部位（箭头所示）。对照组和miR-204模拟物的顶部（肌动蛋白）和底部（明胶和纤维连接蛋白）图像具有相同的光场。条形图（D）上显示的数据是三个独立实验的平均值±标准差。n个是分析的单个细胞的总数。（E） 用miR-204模拟物和阴性对照物处理的野生型或表达FLAG–Rab40b的MDA-MB-231细胞中ECM降解和MMP2和MMP9分泌的定量。所示数据为三个独立实验的平均值±标准偏差。n个是每次治疗分析的细胞总数。western blot显示FLAG–Rab40b表达水平。FIP1用作加载控制。底部凝胶显示了miR-204治疗和FLAG–Rab40b过度表达对MMP2和MMP9分泌的影响，如酶谱分析所测。P（P）-将给出的值与对照组进行比较，并用双尾学生模型计算t吨-测试。
图6。
图6。
miR-204调节乳腺癌细胞中的Tks5水平。（A） Tks5-3′UTR包含两个推测的miR-204种子区域。将包含miR-204种子区的3′UTR片段相邻克隆到psiCheck2双荧光素酶报告载体中，并与miR-204-模拟物或阴性对照物共同转染到细胞中。所示数据为三个独立实验的平均值±标准差。（B） 用抗Tks5抗体对经miR-204模拟物或阴性对照处理的MDA-MB-231细胞进行Western blot检测。FIP1用作加载控件。条形图显示了Tks5水平作为模拟（未处理）的百分比。所示数据为三个独立实验的平均值±标准差。用miR-204模拟物或阴性对照miR处理（C–E）MDA-MB-231细胞，将其嵌入Matrigel+I型胶原混合物中，并孵育4小时 天。然后固定球体，并用抗微管蛋白抗体染色，以量化入侵足的数量和长度（箭头）。所示数据为三个独立实验的平均值±标准差。n个是所分析的球体总数。（F） Tks5敲除（Tks5-KD）对MMP2和MMP9分泌的影响。western blots显示了Tks5被击倒的程度。Tubulin用作加载控制。底部凝胶显示了通过酶谱分析测定的Tks5缺失对MMP2和MMP9分泌的影响。
图7。
图7。
Rab40b介导MMP2和MMP9靶向入侵昆虫的模型。Tks5在PI（3,4）P启动侵入体形成2-富含质膜的区域，并作为一种栓系因子招募含有MMP2和MMP9的Rab40b囊泡。Rab40b和Tks5之间的相互作用允许在入侵足类的ECM中释放MMP2和MMP9。miR-204通过调节Rab40b-和Tks5介导的invadopodia的形成和功能，发挥肿瘤抑制剂的作用。
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