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.2016年12月;157(12):4526-4533.
doi:10.1210/en.2016-1606。 Epub 2016年10月26日。

前列腺酸性磷酸酶改变RANKL/OPG系统并诱导成骨细胞前列腺癌骨转移

附属公司

前列腺酸性磷酸酶改变RANKL/OPG系统并诱导成骨细胞前列腺癌骨转移

亚历山大·基申鲍姆等。 内分泌学. 2016年12月.

摘要

前列腺癌(PCa)在其产生成骨细胞(OB)骨转移的倾向上是独特的。目前还没有专门针对OB期的治疗方法,而OB期影响了90%的骨转移性疾病患者。前列腺酸性磷酸酶(PAP)由OB转移中的PCa细胞分泌,可促进OB生长、分化和骨矿化。本研究的目的是研究PAP对OB骨转移的影响是否通过核因子κ-B(RANK)/RANK配体(RANKL)/骨保护素(OPG)系统受体激活物的自分泌和/或旁分泌改变介导。为了研究PAP是否调节这些因素并改变骨反应,我们降低了VCaP细胞中PAP的表达,并稳定地在PC3M细胞中过度表达PAP,这两种细胞均来自人类PCa骨转移。我们发现,VCaP细胞中PAP的敲低降低了OPG,同时增加了RANK/RANKL的表达。在PC3M细胞中强制过表达PAP具有相反的效果,增加OPG,同时降低RANK/RANKL表达。PCa细胞与MC3T3前成骨细胞共培养也揭示了分泌性PAP在OB-PCa交叉对话中的作用。VCaP细胞中PAP表达减少,MC3T3增殖和分化减少,OPG表达减少。使用胫骨内模型,PC3M细胞中PAP过度表达改变了骨表型,从而在体内形成OB,而不是溶骨性病变。这些发现表明,OB骨转移中PCa细胞分泌的PAP增加了OPG,并在癌症和骨细胞之间的恶性串话中起着关键作用。这些数据表明,抑制分泌性PAP可能是PCa-OB骨损伤的有效策略。

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数字

图1。
图1。
PAP敲低对VCaP PCa细胞的自分泌作用。A、 使用2个独立的PAP引物集(PAP1,PAP2)对VCaP细胞系中siRNA介导的PAP敲低后PAP表达的mRNA分析。B、 用ELISA分析分泌的PAP蛋白。C、 培养4天后进行细胞计数。D、 培养48小时后测定甲基噻唑基二苯基四唑溴。E、 用碘化丙啶(PI)进行DNA细胞周期分析表明,S期细胞减少,G期细胞增加1与对照细胞相比,PAP被击倒的阶段。F、 敲除PAP可降低CyclinD1和PCNA的表达(印迹下的数字表示密度测定的折叠变化)。G、 与对照细胞相比(×10倍放大),PAP被击倒的细胞通过相控显微镜观察的形态学没有改变。H、 siRNA-介导的PAP敲除改变RANKL/OPG轴,增加RANKL和RANK的表达,同时降低OPG蛋白的表达(blot下的数字表示密度测定的倍数变化);*,P(P)< .05; **,P(P)< .005; ***,P(P)< .0005. MTT,甲基噻唑基二苯基四唑溴;增殖细胞核抗原;小干扰RNA。
图2。
图2。
VCaP PCa细胞中PAP敲除对MC3T3成骨前细胞增殖、分化和RANKL/OPG相对表达水平的旁分泌作用。与相同条件下共培养的VCaP siNTC细胞相比,在无血清培养基中与MC3T3共培养的VC aP siPAP细胞的增殖降低。B、 MC3T3,即成骨前细胞,在经过siRNA介导的PAP敲除的VCaP细胞培养基中培养。与对照培养基siNTC相比,在siPAP培养基中培养的细胞的细胞数量在统计学上显著减少。C、 Western blotting显示PCNA蛋白表达水平降低,这是VCaP-siPAP培养基中培养的MC3T3前成骨细胞与VCaP-siNTC对照培养基相比的增殖标志。D、 Western blotting显示,与来自VCaP siNTC的对照培养基相比,在VCaP-siPAP培养基中培养的MC3T3前成骨细胞中,Runx2、骨钙素和骨碱性磷酸酶(成骨细胞分化的标志物)降低。E、 与来自VCaP siNTC的对照培养基相比,在VCaP-siPAP培养基中培养的MC3T3前成骨细胞中,Western blotting显示OPG表达降低,RANKL或RANK表达水平无变化(blot下的数字表示密度测定的倍数变化);*,P(P)< .05; **,P(P)< .005; ***,P(P)<0.0005。
图3。
图3。
PAP在PCa细胞系PC3M中稳定过度表达。A、 用2对独立引物对PAP转染的PC3M-Luc细胞PAP表达的mRNA分析。B、 用ELISA分析分泌的PAP蛋白。PC3M-Luc-PAP分泌的PAP明显多于PC3M-Loc-Control细胞系(浓缩)和PC3M-Lac-PAP(浓缩),尽管少于VCaP PCa细胞的7倍。C、 与对照细胞相比,PC3M-Luc-PAP细胞通过相控显微镜的形态学没有改变。D、 PC3M-Luc细胞中PAP的过度表达增加了OPG的表达,而RANKL或RANK的表达没有改变,从而增加了OPG/RANKL的比率(印迹以下的数字表示密度测定的倍数变化)。E、 与相同条件下共培养的PC3M-Luc-PAP细胞相比,在无血清培养基中与MC3T3共培养的细胞增殖增加;*,P(P)< .05; **,P(P)< .005; ***,P(P)< .0005.
图4。
图4。
PAP过表达对骨中PC3M肿瘤生长的体内影响和骨反应。A、 PC3M-Luc-Control和PC3M-Ruc-PAP荷瘤动物胫骨中显示PCa的代表性样本的WBI。X射线(B)和micro-CT(C)显示,PC3M-Luc-Control细胞诱导了明显的溶骨表型,多个吸收区证明了这一点,而PC3M-Loc-PAP细胞在胫骨内接种后诱导了急变性骨反应(代表性样本)。对照组为每组无肿瘤的对侧胫骨。PC3M-Luc-Control胫骨(n=10)与PC3M-Ruc-PAP胫骨(n=7)溶骨性、混合性和OB表型的比较。D、 H&E染色,用箭头(左下角)描绘PC3M-Luc-Control中的多核破骨细胞(×2和×20放大)。E、 三色染色(深绿色矿化骨;红色类骨,成骨细胞形成的胶原骨基质增加)。PC3M-Luc-Control,左下角,有一些绿色矿化骨,但几乎没有红色,即几乎没有新骨沉积的迹象。PC3M-Luc-PAP,右下角,箭头显示新骨形成的红色区域(类骨质)。M、 肌肉;B、 骨;T、 肿瘤;O、 类骨;OC,破骨细胞;×20倍放大。F、 PAP染色显示PAP在PC3M Luc胫骨内病变中表达,而IHC未显示PAP在PC3M Luc对照胫骨中表达(×40放大倍数)。G、 波形蛋白IHC染色显示波形蛋白在骨基质细胞(黄色箭头)和胫骨病变PC3M细胞(红色箭头)中的表达。波形蛋白在PC3M-Luc-Control细胞和PC3M-Loc-PAP细胞中强烈表达(×40倍放大);*,P(P)< .05; **,P(P)< .005; ***,P(P)< .0005.
图5。
图5。
PAP在产科前列腺癌骨转移中的作用。相邻成骨细胞分泌的RANKL在骨PCa细胞中诱导PAP表达。PCa细胞中PAP表达增强具有自分泌和旁分泌效应。PAP对PCa细胞的自分泌作用包括1)增加G1与RANK/RANKL相比,OPG的PCa细胞相对表达水平增加。OPG通过TRAIL介导的机制使PCa细胞对凋亡产生抵抗。PCa细胞PAP表达/分泌的旁分泌效应包括1)促进成骨细胞的增殖和分化,2)促进骨矿化。活化的成骨细胞分泌可溶性生长因子,进一步增强PCa在骨中的增殖和存活。黑色箭头,刺激;红线/箭头,抑制。

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