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.2016年11月22日；7(47):77764-77776.
doi:10.18632/目标12794。

MicroRNA-3196被H2AX磷酸化抑制并通过下调PUMA抑制肺癌细胞凋亡

徐成山 1 2, 张玲（Ling Zhang） 1, 连宁段 1, 成都路 1
附属公司

MicroRNA-3196被H2AX磷酸化抑制并通过下调PUMA抑制肺癌细胞凋亡

徐成山等。 Oncotarget公司. .

摘要

组蛋白H2AX是一种肿瘤抑制蛋白，在细胞凋亡中起重要作用。然而，H2AX与癌细胞凋亡相关的机制尚不清楚。在这里，我们发现肺癌A549细胞中H2AX的敲低影响了16个microRNA（miRNAs）的表达，导致1的下调和15个microRNAs的上调。MicroRNA-3196（miR-3196）被确定为H2AX的靶点，并通过靶向p53上调的凋亡调节剂（PUMA）抑制肺癌细胞的凋亡。磷酸化H2AX（γH2AX）与miR-3196的启动子结合并调节其表达。此外，H2AX磷酸化增加了miR-3196启动子区域的H3K27三甲基化，并抑制了RNA聚合酶II与miR-3186启动子的结合，导致miR-3176转录受到抑制。综上所述，这些结果表明H2AX磷酸化通过miR-3196/PUMA途径调节肺癌细胞的凋亡。

关键词：彪马；细胞凋亡；组蛋白H2AX；肺癌；miR-3196。

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利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。H2AX磷酸化负调控miR-3196的表达
答：。凋亡期间稳定A549对照（CTR）细胞（三个生物复制品的C-1、C-2和C-3）和稳定H2AX-敲低A549细胞（三种生物复制品中的H-1、H-2和H-3）中miRNAs的差异表达。与CTR相比，VP16处理（100μM）后H2AX-敲低A549细胞中的16个miRNAs被确定为显著上调或下调(P（P）<0.01). 如热图所示，H2AX敲除细胞中一个miRNA显著下调，15个miRNA明显上调。右上角的条表示miRNA表达的信号水平，从-0.53（绿色）到+0.53（红色）。右侧边界显示了显著放松管制的miRNAs的个体身份。B。在VP16（100μM）处理后的A549细胞（CTR）和H2AX-knowdown A549细胞中（H2AX-kd），使用qRT-PCR验证H2AX调节的差异表达miRNAs（顶面板）。U6被用作内部控制。western blotting检测CTR和H2AX-kd细胞中H2AX蛋白水平（底部）。β-actin用于确认等蛋白负荷。C、。将转染H2AX-wt、H2AX-139m或载体的稳定A549细胞用DMSO（顶面板）或VP16（100 M，底面板）处理48 h，然后用qRT-PCR验证差异表达的miRNA。使用U6作为内部控制。D。用qRT-PCR检测凋亡刺激后CTR和H2AX-kd A549细胞中miR-3196的表达。U6被用作内部控制。E.公司。用VP16（100μM）处理转染H2AX-wt、H2AX-139m或载体的稳定A549细胞48 h，qRT-PCR检测miR-3196的表达。U6被用作内部控制。误差条表示平均值±SD**P（P）< 0.01; ***P（P）经Student t检验<0.001。
图2
图2。miR-3196参与肺癌细胞的凋亡
答：。用miR-3196模拟物（miR-3196）或阴性对照miRNA（miRNA.NC）转染24小时的肺癌A549细胞用VP16（100μM）诱导48小时，并通过流式细胞术（FCM）检测凋亡细胞。直方图显示凋亡细胞的百分比，包括早期和晚期凋亡细胞。B。用miR-3196模拟物（miR-3186）转染肺癌H1650细胞24 h，然后用VP16（100μM）处理48 h。如（A）所示检测凋亡细胞。C、。用VP16（100μM）处理转染miR-3196抑制剂或其阴性对照物（miR-3186抑制剂.NC）24 h的A549细胞48 h，并对凋亡细胞进行FCM分析，如（A）所示。D。miR-3196抑制剂或miRNA抑制剂-NC转染24 h后，用VP16（100μM）诱导H1650细胞，并对凋亡细胞进行FCM分析，如（A）所示。E.公司。转染miR-3196模拟物（miR-3186）或miR-3176抑制剂后，在A549和H1650细胞中检测miR-3166的相对表达。U6被用作内部控制。误差条表示平均值±SD**P（P）< 0.01, ***P（P）经Student t检验<0.001。
图3
图3。PUMA是miR-3196的直接功能靶点
答：。miR-3196靶向第642-649个核苷酸的位点残基彪马-3′-UTR。上面板：miR-3196与结合位点的序列比对彪马-3′-UTR。下面板：miR-3196结合位点在彪马-9种植物的3′-UTR。B。荧光素酶报告质粒图，包括全长质粒彪马-3′-UTR插入物（pIS0-PUMA-3′-UTR）和带有突变的质粒彪马-3′-UTR（pIS0-PUMA-3′-UTR-m），在miR-3196结合位点内携带三个核苷酸的取代。C、。将miR-3196模拟物（20 nM）与pIS0-PUMA-3′-UTR或pIS0-PAMA-3′-UTR-m转染A549（左侧）和H1650（右侧）细胞。NC：阴性对照miRNA（miRNA.NC）。pRL-SV40 Renilla用于转染效率的标准化。48小时后，测定荧光素酶活性。D。在A549（上面板）或H1650（下面板）细胞中转染miR-3196模拟物（20 nM）或miR-3186抑制剂（40 nM）后，使用Western blotting检测PUMA蛋白。β-actin作为负荷对照。E.公司。 彪马通过qRT-PCR测量如（D）中处理的A549和H1650细胞系中的mRNA。β-actin作为内部对照*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图4
图4。miR-3196通过下调PUMA抑制VP-16诱导的细胞凋亡
答：。用miR-3196 mimics（miR-3186）转染A549细胞和/或与pcDNA3-PUMA（PUMA）联合转染24 h，然后用VP16（100μM）处理48 h。误差条表示平均值±SD（右侧面板）。B。H1650细胞被转染，并按（A）所述进行处理。流式细胞仪（FCM）检测凋亡细胞。误差条表示平均值±SD（右侧面板）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图5
图5。γH2AX结合miR-3196基因启动子并调节PUMA表达
答：。miR-3196基因启动子示意图（左面板）。将报告基因质粒与H2AX或对照（载体）共转染到A549细胞中，并在转染后48 h测定荧光素酶活性（右侧面板）。pRL-TK Renilla被用作内部控制。数值标准化为Renilla荧光素酶活性**P（P）< 0.01.B。通过western blotting评估VP-16（100μM）诱导后H2AX敲除（上面板）或过度表达（下面板）稳定细胞中BIRC7蛋白水平的表达。C类用qRT-PCR检测H2AX敲除（右面板）或过度表达（左面板和中面板）稳定细胞中的BIRC7 mRNA水平。D类在用VP16（100μM）处理48小时的H2AX wt或H2AX-139m稳定A549细胞上，用IgG（用作对照）、抗H2AX和抗γH2AX进行ChIP。通过qRT-PCR评估miR-3196的H2AX或γH2AX相关启动子DNA量，引物对位于miR-3196启动子区域的侧翼***P（P）< 0.001.E类A549细胞单独转染H2AX或与miR-3196 mimics（上面板）联合转染48 h，通过western blotting检测PUMA表达。将H2AX-siRNA单独或与miR-3196抑制剂（下面板）联合转染A549细胞48 h，western blotting检测PUMA表达。β-actin作为负荷对照**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图6
图6。H2AX磷酸化增加miR-3196启动子区的H3K27三甲基化
答：。用不同浓度的组蛋白甲基转移酶抑制剂（DZNep）（左侧）或组蛋白去乙酰化酶抑制剂（LBH589）（右侧）处理A549细胞，用qRT-PCR检测miR-3196的表达。DMSO处理作为对照。U6被用作内部控制。B。使用H3K27三甲基化抗体或对照IgG从稳定的A549对照细胞、H2AX-wt或H2AX-139m细胞免疫沉淀染色质，并使用位于miR-3196启动子区-1963–-1753位置的引物通过qRT-PCR扩增富集的基因组片段。C、。使用H3K27三甲基化抗体或对照IgG从稳定的A549对照细胞或A549 H2AX敲除细胞（H2AX-kd）中免疫沉淀染色质，并扩增富集的基因组片段，如（B）所示*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图7
图7。H2AX磷酸化抑制RNA聚合酶II与miR-3196启动子的结合
答：。用组蛋白甲基转移酶抑制剂（DZNep 10 mM）和/或VP16（100 mM）处理A549和H1650细胞。使用针对RNA聚合酶II或IgG的抗体作为对照进行染色质免疫沉淀，并使用位于启动子区域-1963–-1753位置的引物扩增富集的基因组miR-3196启动子片段*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.B。γH2AX调节miR-3196转录的模型。
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