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.2016年12月2日;291(49):25729-25741。
doi:10.1074/jbc。M116.7742742。 Epub 2016年10月25日。

p70S6K1(S6K1)介导的磷酸化调节磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶I型γ降解和细胞侵袭

附属公司

p70S6K1(S6K1)介导的磷酸化调节磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶Ⅰ型γ降解和细胞侵袭

纳赛尔·贾法里等。 生物化学杂志. .

摘要

磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶I型γ(PIPKIγ90)的泛素化和随后的降解调节局部黏附组装、细胞迁移和侵袭。然而,尚不清楚上游信号如何控制PIPKIγ90的泛素化或降解。这里我们证明了雷帕霉素(mTOR)机械靶点的下游靶点p70S6K1(S6K1)在Thr-553和Ser-555磷酸化PIPKIγ90,并且S6K1介导的PIPKIα90磷酸化对细胞迁移和侵袭至关重要。此外,PIPKIγ90磷酸化是发展局灶性黏附和侵袭性骨病所必需的,这是细胞迁移和侵袭的关键机制。令人惊讶的是,用丙氨酸取代Thr-553和Ser-555促进了PIPKIγ90的泛素化,但增强了PIPKIγ90的稳定性,S6K1的缺失也增强了PIPKIγ90的稳定,表明PIPKIα90泛素化本身不足以降解其。这些数据表明,S6K1介导的PIPKIγ90磷酸化通过控制PIPKIα90降解来调节细胞迁移和侵袭。

关键词:PIP5K1C;S6激酶;细胞侵袭;细胞迁移;磷脂酰肌醇激酶;蛋白质降解。

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数字

图1。
图1。
S6K1在Thr-553和Ser-555磷酸化PIPKIγ90。 一个,来自不同物种的Akt/S6K1共有序列的比对。B类组成活性Akt1或S6K1转染促进PIPKIγ90磷酸化。将FLAG-PIPKIγ90与空载体Myr-Akt1和S6K1-F5A-E389-R3A共同转染到CHO-K1细胞中。免疫沉淀FLAG-PIPKIγ90,用抗R抗体检测PIPKIα90磷酸化X(X)R(右)XX年pS/T基序抗体。美国。,任意单位;*,第页< 0.05.C类,S6K1在Thr-553和Ser-555磷酸化PIPKIγ在体外.重组GST-PIPKIγ90501–668,-PIPKIγ90501–668T553A型,-PIPKIγ90501–668555安和-PIPKIγ90501–668T553A、S555A用CHO-K1细胞免疫沉淀的组成活性S6K1磷酸化。D类,S6K1磷酸化CHO-K1细胞中Thr-553和Ser-555处的PIPKIγ。HA-S6K1-F5A-E389-R3A与FLAG-PIPKIγ90,-PIPKIγ90共转染T553A型,-PIPKIγ90555安和-PIPKIγ90T553A、S555A转化为CHO-K1细胞。数据以三个独立实验的平均值±S.E.表示。**,第页< 0.01; ***,第页< 0.001重量。E类EGF和HGF刺激PIPKIγ磷酸化。对稳定表达FLAG-PIPKIγ90的MDA-MB-231细胞进行血清饥饿处理,并用EGF(20 ng/ml)、HGF(50 ng/ml(IP(IP)),并用抗R抗体检测到磷酸化X(X)R(右)XX年pS/T基序抗体。数据以三个独立实验的平均值±S.E.表示。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01控制(Ctrl键).F类,HGF刺激的PIPKIγ磷酸化被Akt和S6K1抑制剂抑制。稳定表达FLAG-PIPKIγ90的MDA-MB-231细胞血清饥饿,用Akt抑制剂VIII和S6K1抑制剂DG2(10μ)或PF4708671(10μ),然后用HGF刺激20分钟。数据表示为四个独立实验的平均值±S.E.。*,第页< 0.05HGF公司。G公司,HGF刺激的PIPKIγ磷酸化被S6K1缺失所抑制。使用表达S6K1 shRNAs的慢病毒去除稳定表达FLAG-PIPKIγ90的MDA-MB-231细胞中的S6K1。细胞需要血清,然后用HGF(20 ng/ml)刺激20分钟。数据表示为三个独立实验的平均值±S.E.。*,第页< 0.05.
图2。
图2。
PIPKIγT553A、S555A抑制细胞迁移。 一个,表达ZZ-PIPKIγ,-PIPKIγT553A、S555A,或-PIPKIγT553E、S555E在PIPKIγ缺失的MDA-MB-231细胞中。B类,表达对照的MDA-MB-231细胞的迁移轨迹(Ctrl键)shRNA和PIPKIγ缺失的MDA-MB-231细胞,稳定表达ZZ-PIPKIγ,-PIPKIγT553A、S555A,或-PIPKIγT553E、S555E.C类、表达对照shRNA的细胞和稳定表达ZZ-PIPKIγ、-PIPKI-γ的PIPKIγ缺失细胞的速度、净距离、总路径和方向性的统计结果T553A、S555A,或-PIPKIγT553E、S555E。数据表示为三个独立实验中40多个细胞的平均值±S.E.。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.D类,稳定表达FLAG-PIPKIγ或-PIPKIγ90的PIPKI缺失MDA-MB-231细胞T553A、S555A用纤维连接蛋白镀膜,固定,并用抗PIPKIγ和抗paxillin抗体共同染色。PIPKIγ和paxillin的图像通过TIRF显微镜获得。E类,在稳定表达FLAG-PIPKIγ90的细胞中,在FAs处的帕罗西汀的面积分布重量或-PIPKIγT553A、S555A数据为三个独立实验的平均值±S.E。在每次实验中,分析并绘制每组20个细胞的FA。*,第页< 0.05; ***,第页< 0.001重量。
图3。
图3。
S6K1介导的PIPKIγ90磷酸化对入侵至关重要。 一个、PIPKIγ90和PIPKIα90T553E、S555E恢复PIPKIγ缺失细胞的侵袭能力T553A、S555A没有。PIPKIγ缺失的MDA-MB-231细胞被表达密码子修饰的ZZ-PIPKIγ90、-PIPKIγ90的逆转录病毒感染T553A、S555A或PIPKIγ90T553E、S555E然后用新霉素进行筛选。表达shRNA控制的细胞(Ctrl键)用作对照。没有,没有。B类,中实验的量化A.白柱,无HGF;灰色列,20 ng/ml HGF。数据表示为平均值±S.E。,n个= 3. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01shRNA A1。C类,在缺乏MDA-MB-231细胞的情况下抑制其侵袭(白色列)和存在(灰色列)S6K1抑制剂DG2对HGF的抑制作用。数据是三个独立实验的平均值±S.E.。**,第页< 0.01.D类表达对照shRNA或S6K1 shRNA的MDA-MB-231细胞中S6K1和Akt激活。E类shRNA去除S6K1抑制MDA-MB-231细胞的侵袭。数据以三个独立实验的平均值±S.E.表示。**,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.F类在表达对照shRNA或Akt1 shRNA的MDA-MB-231细胞中,S6K1和核糖体蛋白S6磷酸化。G公司,Akt1敲低对MDA-MB-231细胞的侵袭没有显著影响。白色列,无HGF;粉红色立柱,带有HGF。数据表示为三个独立实验的平均值±S.E。H(H)、S6K1抑制剂DG2对表达ZZ-PIPKIγ90、-PIPKIγ90的PIPKI缺失MDA-MB-231细胞侵袭的影响T553A、S555A,或-PIPKIγ90T553E、S555E在DG2存在的情况下进行细胞侵袭(黑色列, 10 μ)或车辆(白色列)在较低的腔室中使用HGF(20 ng/ml)。数据是三个独立实验的平均值±S.E.。*,第页< 0.05; ***,第页< 0.001.
图4。
图4。
S6K1介导的PIPKIγ磷酸化对基质降解至关重要。 一个,PIPKIγ的影响T553A、S555A和PIPKIγT553E、S555EPIPKIγ缺失细胞中的明胶降解。表达FLAG-PIPKIγ90,-PIPKIγ90的γ缺失MDA-MB-231细胞T553A、S555A,或-PIPKIγ90T553E、S555E将其重新悬浮在含有1%FBS和HGF的DMEM中,置于Alexa 488明胶涂层的玻璃底皿上,培养10h。比例尺=20微米。B类,中实验的量化一个。数据表示为三个独立实验的平均值±S.E.。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01shRNA控制(Ctrl键).澳大利亚,任意单位。C类,通过S6K1抑制剂DG2抑制MDA-MB-231细胞中因瓦霉素的形成。数据以三个独立实验的平均值±S.E.表示。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001控件。
图5。
图5。
S6K1激活与人类临床标本中的乳腺癌转移相关。 一个用抗磷酸-S6核糖体蛋白抗体对人乳腺癌原发肿瘤和匹配的淋巴结转移肿瘤进行染色。B类磷酸化S6染色强度从0~4分,以4分最强。澳大利亚,任意单位。
图6。
图6。
S6K1介导的磷酸化调节PIPKIγ降解。 一个PIPKIγ的稳态水平重量,PIPKIγT553A、S555A和PIPKIγT553E、S555E瞬时转染FLAG-PIPKIγ的CHO-K1细胞重量,-PIPKIγT553A、S555A和-PIPKIγT553E、S555E分别用DMSO或carfilzomib(1μ).B类用丙氨酸而不是谷氨酸取代Thr-553和Ser-555,抑制了PIPKIγ的降解。用Avi-PIPKIγ转染表达BirA的CHO-K1细胞重量,-PIPKIγT553A、S555A,和-PIPKIγT553E、S555E并用生物素标记。用Dylight 680-streptavidin进行Western blotting检测PIPKIγ水平。C类,PIPKIγ降解的时间过程重量,PIPKIγT553A、S555A和PIPKIγT553E、S555E在CHO-K1细胞中。数据代表三个实验的平均值±S.E.。**,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.D类,CHO-K1细胞用Dendra2 PIPKIγ90瞬时转染重量,-皮普基γ90T553A、S555A和-PIPKIγ90T553E、S555E并涂上纤维粘连蛋白。用408-nm激光照射细胞2分钟,将Dendra2融合蛋白转化为红色Dendra1融合蛋白。使用延时成像记录红色荧光的强度。比例尺=20微米。E类,Dendra2-PIPKIγ90降解的定量重量,-PIPKIγ90T553A、S555A和-PIPKIγ90T553E、S555E数据表示为四个独立实验的平均值±S.E。F类,S6K1抑制剂DG2或PF4708671稳定PIPKIγ90重量用Dendra2-PIPKIγ90转染CHO-K1细胞重量转染24小时后,用DG2(10μ)或PF4708671(10μ)30分钟,然后使用408-nm激光照射2分钟。数据表示为三个实验的平均值±S.E。G公司,S6K1抑制剂DG2(10μ)对Dendra2-PIPKIγ90的降解几乎没有影响T553A、S555E数据表示为三个实验的平均值±S.E。
图7。
图7。
PIPKIγ90降解是癌细胞介导的基质降解所必需的。 一个,PIPKIγ的泛素化重量,-PIPKIγT553A、S555A,和-PIPKIγT553E、S555E。Avi-ubiquitin公司(Avi-Ub公司)与ZZ-PIPKIγ共转染重量,-PIPKIγT553A、S555A和-PIPKIγT553E、S555E转化为表达BirA的CHO-K1细胞。用生物素标记细胞,用IgG-琼脂糖免疫沉淀ZZ标记蛋白。使用Dylight 680-抗坏血酸检测泛素化。数据是两个独立实验的代表。B类表达空pLKO.1载体或S6K1 shRNAs的MDA-MB-231细胞中PIPKIγ的稳态水平,用DMSO或carfilzomib处理(卡夫, 5 μ). 数据以三个独立实验的平均值±S.E.表示。*,第页< 0.05.Ctrl键,控制。C、 表达空pLKO.1载体或Akt1 shRNA的MDA-MB-231细胞经二甲基亚砜或硼替佐米/卡非佐米处理后PIPKIγ的稳态水平(B类+C类, 1 μ每个)。数据表示为三个独立实验的平均值±S.E。D类、表达对照shRNA或PIPKIγshRNA A1的MDA-MB-231细胞和稳定表达ZZ-PIPKIγ和-PIPKIγ的PIPKIβ缺失细胞中PIPKIα的表达水平K97R公司.E类,PIPKIγ重量PIPKIγ缺失MDA-MB-231细胞中明胶降解的恢复K97R公司,一个普遍缺乏蛋白质的突变体,却没有。比例尺=20微米。F类,E中实验的量化。数据为三个独立实验的平均值±S.E.。*,第页< 0.05.澳大利亚,任意单位。

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