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.2016年10月20日；11（10）：e0165061。
doi:10.1371/journal.pone.0165061。 电子收集2016。

ADAMTS-1存在于正常和肿瘤乳腺细胞核中

苏埃利·席尔瓦 1, 马伊拉·A·利马 1, 纳塔莉·塞拉 1, 鲁·G·杰格 1, 凡妮莎·M·弗里塔斯 1
附属公司

ADAMTS-1存在于正常和肿瘤乳腺细胞核中

苏利·席尔瓦等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

肿瘤细胞在细胞外基质微环境（ECM）中分泌的蛋白质参与细胞粘附、运动、细胞间通讯和侵袭。蛋白酶对肿瘤微环境进行了扩展性的修饰和重塑，导致细胞与细胞之间和细胞与ECM之间的相互作用以及从细胞表面产生新信号的重要变化。属于ADAMTS（一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶）家族的金属蛋白酶与癌症发展、生长和进展中观察到的组织重塑事件有关。在这里，我们研究了ADAMTS-1在正常（MCF10-A）和肿瘤（MCF7和MDA-MB-231）人类乳腺细胞中的亚细胞定位。ADAMTS-1是一种在细胞外基质中发现的分泌性蛋白酶。然而，在本研究中，我们首次表明，在这里研究的三个乳腺细胞系的细胞核和核仁中也存在ADAMTS-1。我们的研究结果表明，ADAMTS-1通过与聚集蛋白聚糖底物的相互作用在细胞核中具有蛋白水解功能。

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数字

图1
图1。ADAMTS-1主要存在于细胞核中。
在MCF-10A（A）、MCF-7（C）和MDA-MB-231（D）细胞系中，免疫荧光显示ADAMTS-1定位于细胞核，ADAMTS-4和ADAMTS-5定位于细胞质。ADAMTS-1和细胞核的彩色化在正交投影中很明显（B，黑色箭头）。B中的红线表示XY图像的投影点，以生成正交平面XZ和YZ。ADAMTS-1、ADAMTS-4和ADAMTS-5（红色）、F-actin（绿色）和细胞核（蓝色）。比例尺：5μm。
图2
图2。ADAMTS-1位于细胞核内。
免疫荧光显示ADAMTS-1和核磷蛋白在MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞系（A）中共定位。用于共定位分析的MDA-MB-231图像（B），白线用于生成线扫描图（C）。线扫描轮廓显示ADAMTS-1（红色）和核磷蛋白（绿色）之间有明显重叠。同位化颜色图用C表示，其中热色表示正相关（同位化），冷色表示排除。ADAMTS-1（红色，x轴）和核磷蛋白（绿色，y轴）与线性回归线的散点图（D）。散点图中的点围绕回归线聚集。ADAMTS-1（红色）、核磷蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。比例尺，5μm。
图3
图3。ADAMTS-1蛋白主要存在于细胞核中。
含有MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞的细胞质和细胞核组分的Western blot检测ADAMTS-1、β-肌动蛋白、组蛋白和GAPDH。
图4
图4。ADAMTS-4和ADAMTS-5位于细胞质中。
含有MCF-10A（A）、MCF-7（B）和MDA-MB-231（C）细胞细胞质和细胞核组分的Western blot检测ADAMTS-4、ADAMTS-5、β-肌动蛋白、组蛋白和GAPDH。
图5
图5。ADAMTS-1和Aggrecan都在细胞核中。
（A） ADAMTS-1和aggrecan的克隆化。ADAMTS-1（红色）、Aggrecan（绿色）和Nuclei（蓝色）。Aggrecan存在于细胞核和细胞质中，并与ADAMTS-1在MCF7和MDA-MB-231的细胞核（白色箭头）中共定位。比例尺：5μm。（B） 含有MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞的细胞质和细胞核组分的Western blot检测Aggrecan、β-actin、组蛋白和GAPDH。（C-D）消化后Aggrecan Western blot。车道1：来自牛关节软骨的Aggrecan（500 nM）；通道2：来自牛关节软骨（500 nM）的Aggrecan与30μg MCF-7核组分孵育；通道3:30μg MCF-7核分数。对所有样品进行消化（在37°C下过夜）和脱糖试验（在37℃下1小时）。红色箭头表示核蛋白酶的蛋白水解产物。用两种不同的商业抗体探测同一膜。（C） 使用西格玛抗聚集聚糖（SAB 4500662）进行高和低暴露。（D） 使用来自Abcam（#3778）的抗聚集聚糖进行高和低暴露。
图6
图6。siRNA处理降低MDA-MB-231细胞的ADAMTS-1核模式。
（A） 免疫荧光显示经siRNA处理的细胞核ADAMTS-1（红色）面积减少。（B） 利用图像J对细胞核中ADAMTS-1的存在进行量化。与对照组相比，核粒径较小，ADAMTS1减少。（C） 免疫印迹显示，经siRNA（装箱）处理的细胞中，细胞核部分和条件培养基的ADAMTS-1减少。（D-E）消化后Aggrecan Western blot。车道1：来自牛关节软骨的Aggrecan（300 nM）；通道2：来自牛关节软骨（300 nM）的Aggrecan与30μg MDA-MB-231核组分孵育；通道3:30μg MDA-MB-231核馏分。通道4：来自牛关节软骨（300 nM）的Aggrecan与30μg MDA-MB-231核组分孵育（siRNA处理）。通道5:30μg MDA-MB-231核分数（siRNA处理）。对所有样品进行消化（在37°C下过夜）和脱糖试验（在37℃下1小时）。红色箭头表示核蛋白酶的蛋白水解产物。方框区域（红色）表示没有蛋白水解酶带。用两种不同的商业抗体探测同一膜。（D） 用来自Sigma（SAB 4500662）的抗聚集聚糖探测膜。（E） 用来自Abcam（#3778）的抗聚集聚糖探测膜。
图7
图7。ADAMTS-1存在于浸润性导管癌细胞的细胞核上，但不存在于正常乳腺组织的管腔细胞上。
（A） 免疫组织化学显示ADAMTS-1位于癌细胞核内（箭头指向点状结构）。分裂下的细胞或基质样细胞不存在ADAMTS-1（箭头）。（B） 在正常组织中，ADAMTS-1存在于基底细胞的细胞核和细胞质上，但不存在于管腔细胞上。比例尺：50μm。
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赠款和资金

这项调查得到了圣保罗州研究基金会圣保罗基金会的支持（FAPESP赠款2010/07699-1和2015/02498-1，VMF）。SVS和MAL目前获得博士研究生奖学金（FAPESP 2015/09845-9和2015/19773-5）。SVS和MAL曾获得FAPESP硕士研究金（2012/10053-1和2013/01092-6）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。