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.2016年10月20日：6:35631。
doi:10.1038/srep35631。

膜锚定配体和受体酵母双杂交系统的建立及其与配体受体相互作用的鉴定

李晶晶 1, 金高 1, 雷汉 1, 张银杰 1, 文冠 2, 梁舟 2, 严羽 2, 魏翰 1
附属公司

膜锚定配体和受体酵母双杂交系统的建立及其与配体受体相互作用的鉴定

李晶晶等。 科学代表. .

摘要

识别配体和跨膜受体之间的相互作用对于理解内分泌系统至关重要。然而，目前用于此目的的方法仍然不能进行高通量筛选。在本报告中，建立了膜锚定配体和受体酵母双杂交（MALAR-Y2H）系统。在该方法中，细胞外配体通过嵌合跨膜结构与细胞内分裂-泛素报告系统相连。同时，跨膜受体的猎物蛋白与分裂-泛素报告系统的另一半融合。配体和受体的胞外相互作用可以导致酵母泛素报告系统的功能恢复，最终导致报告基因的表达。因此，该系统可用于检测细胞外配体及其跨膜受体之间的相互作用。为了验证该方法的有效性和通用性，分析了小鼠几种配体和受体之间的相互作用。检测结果与现有知识完全一致，表明MALAR-Y2H可以用于该目的，具有高精度、高效率和较强的通用性。MALAR-Y2H的简单程序和高通量潜力使其成为研究分泌蛋白和跨膜蛋白之间蛋白质相互作用网络的强大平台。

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数字

图1
图1。诱饵和猎物质粒的设计以及检测相互作用的原理。
(A类)诱饵质粒的结构。（i） CXCL12在N末端与信号肽（SP）融合，在C末端与跨膜肽（TMP）融合，然后与C融合ub公司和GAL4串联。（ii）WBP1与C融合ub公司和GAL4作为对照。诱饵基因被克隆到质粒pGAD-T7中。(B类)猎物质粒的结构。（iii）猎物融合由SP、CXCR和N组成ub公司G公司同时进行。（iv）OST1与N融合ub公司G公司作为控制猎物。将捕食基因克隆到质粒pGBK-T7中。(C类)检测交互的原则。（v） 诱饵蛋白以跨膜蛋白的形式表达，其中CXCL12结构域直接进入内腔（和周质，如果成熟形式位于质膜上）并与Cub公司-TMP在细胞质中的GAL4盒。CXCRs-N系列ub公司G公司在质膜上共表达。CXCL12和CXCR的相互作用将Cub公司和Nub公司G公司并导致分裂的泛素蛋白的重建，其被UBP识别和切割以释放GAL4。释放的GAL4蛋白通过SV40核定位信号在其N端转运到细胞核，并转录报告基因lacZ公司,HIS3型和阿德2在SD/His上生成蓝色克隆−阿德−在有α-X-Gal.（vi）WBP1-C的共表达ub公司-GAL4和OST1-Nub公司G公司作为阳性相互作用蛋白对照。这两个基因是已知的酵母膜蛋白的相互作用伙伴。（vii）SP-CXCL12-TMP-C的共表达ub公司-GAL4和OST1-Nub公司G公司，两个不相关的基因，作为阴性对照。
图2
图2。不同信号肽诱饵和猎物的亚细胞定位。
(A类)诱饵质粒的结构。pGAD-T7载体被用作诱饵质粒的主干，其中诱饵基因由ADH1启动子促进。三种不同的信号肽，（i）SPCXCL12系列，（ii）SPWBP1项目，或（iii）SPMFAL1公司在CXCL12的N末端融合，TMP的跨膜肽WBP1项目和EGFP串联融合到CXCL12的C末端。（iv）WBP1-EGFP作为阳性对照。(B类)猎物质粒的结构。pGBK-T7载体被用作猎物质粒的骨架，其中通过ADH1启动子促进猎物。（v） 带有天然N末端的CXCR4或与不同信号肽融合的CXCR4.（vi）SPWBP1项目，（vii）SP成本1，或（viii）SPMFAL1公司在C末端用EGFP标记。（ix）OST1-EGFP用作对照。(C、 D类)EGFP的LSCM图像。诱饵（i’-iv’）和猎物（v’-ix’）分别用GoldY2H和Y187表达，并用LSCM观察。捕获并合并EGFP和膜特异性荧光染料DiI以及透射光的图像。条形图显示10微米。箭头指示诱饵和猎物的膜定位，星号指示意外的细胞内定位。
图3
图3。CXCL12和CXCR系列的PPI。
(A类)自我激活检测。表达SP诱饵蛋白的GoldY2H细胞CXCL12系列，SPWBP1项目和SPMFAL1公司检测到信号肽能够自我激活。将五微升稀释悬浮液滴入SD/Trp−阿德−伊斯−带有的板α-X-gal和3-AT，生长72年 小时(B类)细胞生长试验。表达SP的GoldY2H细胞CXCL12系列-CXCL12-TMP-Cub公司-GAL4质粒与表达每个SP的Y187细胞杂交OST1系统测试-CXCR-N公司ub公司G公司融合蛋白和二倍体细胞滴入SD/Leu−晶体管−阿德−伊斯−包含α-X加仑和15 mM 3-AT。72天后观察细胞生长 h培养。服务提供商CXCL12系列-CXCL12-TMP-Cub公司-GAL4×OST1-Nub公司G公司作为阴性对照，WBP1-Cub公司-GAL4×OST1-Nub公司G公司作为阳性对照。(C类)表达SP的细胞生长测定CXCL12系列-CXCL12-TMP-Cub公司-GAL4和CXCR-Nub公司一、(D类)表达SP-CXCL12-TMP-Cub-GAL4和每个SP的二倍体细胞的定量β-Gal分析OST1系统测试-CXCR-N公司ub公司G公司蛋白质。实验独立重复三次，每个样品在每个实验中测试两次(n个 = 2). (E类)裂解GAL4的Western blot分析。表达SP的二倍体细胞CXCL12系列-CXCL12-TMP-Cub公司-GAL4和每个CXCR-Nub公司G公司蛋白裂解，用western blot检测GAL4水平。SP的分子量（MW）CXCL12系列-CXCL12-TMP-Cub公司-GAL4是59 kDa，裂解GAL4的MW为31 kDa。该实验独立进行了三次。星号表示非特定带。
图4
图4。检测CXCL12和嵌合CXCR5之间的PPI。
(A类)CXCR5和CXCR3嵌合受体的结构。CXCR5的四个细胞外片段与CXCR3的对应物交换以形成八个嵌合受体。(B类)细胞生长检测。表达SP的二倍体细胞CXCL12系列-CXCL12-TMP-Cub公司-GAL4和CXCR5-Nub公司G公司，CXCR3-Nub公司G公司，或Nub公司G公司通过选择板（SD-Leu）上的生长能力检测到标记的嵌合受体−Trp公司−阿德−伊斯−)带15个 毫微米3AT + α-X-gal（左列）。含有诱饵和N的二倍体细胞ub公司我检测到带标签的猎物（右栏）。阳性和阴性对照细胞与图3B相同。(C类)western blot检测表达。western blot检测EGFP标记的嵌合猎物。(D类)表达SP的二倍体细胞的定量β-Gal分析CXCL12系列-CXCL12-TMP-Cub公司-GAL4和Nub公司G公司标记的嵌合受体。实验独立重复三次，每个样品在每个实验中测试两次(n个 = 2). * 和***表示重要性第页 < 0.05和第页 < 嵌合受体和野生型对应物之间的t检验为0.001。
图5
图5。检测CXCL12和CXCR5之间的相互作用NT公司.
(A类)CXCL12与CXCR5或CXCR3的N末端之间的相互作用通过传统的Y2H检测，其中CXCL12与GAL4（AD）的激活结构域融合作为诱饵，并且CXCR5NT公司或CXCR3NT公司与GAL4的结合域（BD）融合为猎物。仅表达AD-CXCL12和BD-CXCR5的酵母NT公司能够在选择性培养基中存活，表明猎物和诱饵之间存在相互作用。(B类)CXCL12和CXCR5的CoIPNT公司CXCL12和CXCR5NT公司-Fc或CXCR3NT公司-Fc共转染293T细胞系。Fc标记的融合蛋白用蛋白G珠沉淀，沉淀用SDS-PAGE分离并用兔抗小鼠CXCL12 IgG印迹。结果表明，CXCR5沉淀了CXCL12NT公司-Fc，但不是CXCR3NT公司-仅Fc或Fc，表示CXCR5之间的交互NT公司和CXCL12。
图6
图6。MALAR Y2H方法的普遍性研究。
(A类)CXCL7和CXCL9被检测到带有CXCR家族受体（CXCRn-N）的PPIub公司G） 结果显示，各受体的PPI强度不同，其中CXCL7和CXCR2之间以及CXCL9和CXCR3之间检测到明显的PPI。(B类)检测白细胞介素配体/受体对IL1A/IL1R1和IL6/IL6RA的相互作用。CXCL12和CXCR4分别作为诱饵和猎物的阴性对照，Ost1-Nub公司我被用作积极的猎物控制。通过生长分析，IL1A/IL1R1和IL6/IL6RA的预期相互作用被正确检测到，同时，在不匹配的配体/受体对之间没有检测到串扰。
图7
图7。跨膜蛋白库构建策略。
(A类)II型和IV-A型跨膜蛋白在细胞质膜内侧有一个N末端。N个ub公司G公司直接标记在cDNA的5′端作为报告模块。(B类)I型、III型和IV-B型蛋白质的N末端位于细胞质膜的外侧。Nub公司G公司通过跨膜肽和连接子融合到cDNA的5′端。跨膜肽介导N的细胞内定位ub公司G公司同时，连接体为猎物的N末端提供了足够的灵活性，以维持其天然结构。
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