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.2016年11月8日;7(45):72503-72517.
doi:10.18632/目标12700。

汉黄芩素可预防TLR4-NF-κB药物引起的神经炎症,并提高视神经挤压后视网膜中视网膜神经节细胞的存活率

附属公司

汉黄芩素可预防TLR4-NF-κB药物引起的神经炎症,并提高视神经挤压后视网膜中视网膜神经节细胞的存活率

岳旭等。 Oncotarget公司. .

摘要

青光眼视网膜神经节细胞(RGCs)的死亡与慢性神经炎症有关。本研究的目的是确定汉黄芩素是否能够抑制视神经挤压(ONC)后的炎症反应并挽救RGC死亡,ONC是一种理想的青光眼动物模型。建立ONC模型后10分钟腹腔注射汉黄芩素。在本研究中,汉黄芩素治疗减少了RGC的丢失,并抑制了RGC凋亡,这分别通过在ONC后第14天Brn3a标记RGC的增加和第7天裂解caspase-3的表达降低来证明。在ONC模型中,GFAP阳性胶质细胞和iba1阳性小胶质细胞的数量增加,再加上第7天视网膜释放的促炎细胞因子水平升高。然而,在wogonin治疗后,这些反应大多被抑制。ONC后第1天视网膜TLR4表达水平、NF-κB-P65核定位和NF-κ的B-P65磷酸化水平升高,汉黄芩素治疗后显著降低。这些结果表明,汉黄芩素通过抑制TLR4-NF-κB通路保护视网膜神经干细胞的存活,并抑制ONC后视网膜的神经炎症。我们认为汉黄芩素可能是治疗青光眼的一种可能策略。

关键词:病理科;TLR4-NF-κB通路;青光眼;炎症反应;视网膜神经节细胞;汉黄芩素。

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利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。汉黄芩素对ONC术后视网膜RGC丢失的影响
在ONC后第14天采集不同组的大鼠视网膜,用Brn3a进行整体免疫染色和western blot分析。答:。用Brn3a(红色)对对照组、汉黄芩素组、ONC组、ONC-plus-20mg/kg汉黄芪素组,ONC-plus-30mg/kg汉黄连素组,OCC-plus-40mg/kg汉黄素组的代表性图像进行染色。比例尺=100μm。B。汉黄芩素对GCL中RGC存活率影响的密度分析,通过计算荧光Brn3a染色RGC的数量进行评估。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人***第页< 0.001).C、。western blot分析评估Brn3a蛋白水平。使用β-肌动蛋白以确保负载均匀。D。汉黄芩素对Brn3a蛋白表达影响的密度分析。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人***第页< 0.001, **第页< 0.01).E.公司。在腹腔注射不同浓度的汉黄芩素后第14天测量体重。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人*第页与40 mg/kg汉黄芩素组相比<0.05对照组,##第页与ONC-plus-40 mg/kg汉黄芩素组相比<0.01ONC组)。
图2
图2。汉黄芩素对ONC术后视网膜TUNEL阳性RGC密度的影响
在ONC后第7天采集不同组的大鼠视网膜,用TUNEL进行冰冻切片免疫染色。答:。对照组、汉黄芩素组、ONC组、ONC-plus-wogonin组大鼠视网膜采用TUNEL(绿色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺=100μm。B。汉黄芩素对GCL中RGC凋亡率影响的密度分析,通过计算TUNEL阳性RGC的数量进行评估。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6个***第页与ONC组相比<0.001对照组,###第页与ONC-plus-wononin组相比<0.001ONC组)。缩写:GCL,神经节细胞层;INL,内核层;IPL,内丛状层;ONL,外核层。
图3
图3。汉黄芩素对ONC后视网膜caspase-3活性的影响
在ONC后第7天采集不同组的大鼠视网膜,并进行冰冻切片免疫染色和切割caspase-3的western blot分析。答:。对照组、汉黄芩素组、ONC组、ONC-plus-wogonin组大鼠视网膜分别用NeuN(红色)、cleaved-caspase-3(绿色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺=100μm。B。通过western blot分析评估切割型蛋白酶-3的蛋白水平。使用β-肌动蛋白以确保负载均匀。C、。汉黄芩素对裂解caspase-3蛋白表达影响的密度分析。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人***第页与ONC组相比<0.001对照组,##第页与ONC-plus-wononin组相比<0.01ONC组)。缩写:GCL,神经节细胞层;INL,内核层;IPL,内丛状层;ONL,外核层。
图4
图4。汉黄芩素对ONC术后视网膜IPL中GFAP阳性纤维数量的影响
在ONC后第7天采集不同组的大鼠视网膜,用GFAP进行冰冻切片免疫染色和western blot分析。答:。对照组、汉黄芩素组、ONC组、ONC-plus-wogonin组大鼠视网膜分别用GFAP(红色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺=100μm。B。汉黄芩素对胶质细胞功能障碍影响的密度分析,通过计算IPL中GFAP阳性纤维的数量进行评估。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人***第页与ONC组相比<0.001对照组,##第页与ONC-plus-wononin组相比<0.01ONC组)。C、。western blot分析评估GFAP蛋白水平。使用β-肌动蛋白以确保负载均匀。D。汉黄芩素对GFAP蛋白表达影响的密度分析。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人***第页与ONC组相比<0.001对照组,##第页与ONC-plus-wononin组相比<0.01ONC组)。缩写:GCL,神经节细胞层;INL,内核层;IPL,内丛状层;ONL,外核层。
图5
图5。汉黄芩素对ONC后视网膜小胶质细胞活化的影响
在ONC后第7天采集不同组的大鼠视网膜,用iba1进行冰冻切片免疫染色和western blot分析。答:。对照组、汉黄芩素组、ONC组和ONC-plus-wogonin组大鼠视网膜分别用iba1(红色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺=100μm。B。-D。汉黄芩素对小胶质细胞激活作用的密度分析,通过计算iba1阳性的总小胶质细胞数量进行评估B。,具有树突状表型的小胶质细胞C、。或变形虫细胞D。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人*第页< 0.05 **第页与ONC组相比<0.01对照组,#第页与ONC-plus-wononin组相比<0.05ONC组)。E.公司。western blot分析检测iba1蛋白水平。使用β-肌动蛋白以确保负载均匀。F、。汉黄芩素对iba1蛋白表达影响的密度分析。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人**第页与ONC组相比<0.01对照组,##第页与ONC-plus-wononin组相比<0.01ONC组)。缩写:GCL,神经节细胞层;INL,内核层;IPL,内丛状层;ONL,核外层。
图6
图6。wogonin对ONC后视网膜促炎细胞因子释放的影响
在ONC后第7天采集不同组的大鼠视网膜,并进行实时PCR分析。采用实时PCR定量检测对照组、汉黄芩素组、ONC组和ONC-plus-wogonin组视网膜中TNF-α(图6A)、MCP-1(图6B)、iNOS(图6C)、IL-6(图6D)、IL-1β(图6E)和COX-2(图6F)基因的mRNA水平。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人***第页与ONC组相比<0.001对照组,#第页< 0.05,##第页< 0.01,###第页与ONC-plus-wononin组相比<0.001ONC组)。
图7
图7。汉黄芩素对ONC后视网膜TLR4-NF-κB通路激活的影响
在ONC后第1天采集不同组的大鼠视网膜,并进行western blot分析。答:。western blot分析检测对照组、汉黄芩素组、ONC组和ONC-plus-wogonin组视网膜TLR4蛋白水平。使用β-肌动蛋白以确保负载均匀。B。汉黄芩素对TLR4蛋白表达影响的密度分析。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人***第页与ONC组相比<0.001对照组,##第页与ONC-plus-wononin组相比<0.01ONC组)。C、。使用核提取物试剂盒制备核提取物。使用ELISA试剂盒测量NF-κB-P65活性。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人**第页与ONC组相比<0.01对照组,#第页与ONC加wogonin组相比<0.05ONC组)。D。采用western blot分析检测对照组、汉黄芩素组、ONC组和ONC-plus-wogonin组视网膜中p-NF-κB-P65和t-NF-κ的B-P65蛋白水平。使用β-肌动蛋白以确保负载均匀。E.-F.公司。汉黄芩素对p-NF-κB-P65和t-NF-κ)B-P65蛋白表达影响的密度分析。数据显示为平均值±SEM(n个=每组6人***第页与ONC组相比<0.001对照组,###第页与ONC-plus-wononin组相比<0.001ONC组)。缩写:p,磷酸化;t、 总计。

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