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.2016年11月25日；291(48):24986-25003.
doi:10.1074/jbc。M116.744284。 Epub 2016年10月13日。

靶向线粒体蛋白VDAC1的新化合物抑制细胞凋亡和保护线粒体功能障碍

丹亚·本·哈伊 1, 拉切利·贝加斯·什瓦茨 1, 莫兰·沙列夫 1, 安娜·施特伊弗尔·库兹明 1, 阿里·格鲁兹曼 2, 西蒙娜·雷纳 三 4, 维托·德平托 三, 瓦尔达·肖珊·巴马茨 5
附属公司

靶向线粒体蛋白VDAC1的新化合物抑制细胞凋亡并保护线粒体免受线粒体功能障碍

丹亚·本·哈伊等。 生物化学杂志. .

摘要

细胞凋亡被认为在一些病理过程中起着关键作用，例如神经退行性疾病（即帕金森病和阿尔茨海默病）和各种心血管疾病。尽管凋亡机制已经明确，但仍没有实质性的治疗策略来阻止甚至减缓这一过程。因此，对能够阻止或减缓神经退行性疾病和心血管疾病中细胞凋亡的治疗药物的需求尚未得到满足。线粒体外膜蛋白电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）是多种细胞生存和死亡信号（包括凋亡）的汇聚点。最近，我们证明VDAC1寡聚参与线粒体介导的凋亡。因此，VDAC1齐聚反应是设计用于调节细胞凋亡的药物的主要靶点。在这里，采用高通量化合物筛选和药物化学来开发与VDAC1直接相互作用并防止VDAC1寡聚化的化合物，同时抑制各种方法和各种细胞系中诱导的凋亡。这些化合物可防止凋亡相关的线粒体功能障碍，恢复耗散的线粒体膜电位，从而降低细胞能量和新陈代谢，减少活性氧化物种的产生，并防止与线粒体结合的己糖激酶的脱落和细胞内钙的破坏2+水平。因此，本研究描述了具有明确作用机制的新型候选药物，包括抑制VDAC1齐聚、凋亡和线粒体功能障碍。化合物VBIT-3和VBIT-4为治疗与增强凋亡相关的不同疾病提供了一种治疗策略，并指出VDAC1是治疗干预的一个有希望的靶点。

关键词：细胞凋亡；生物发光共振能量转移；药物开发；膜蛋白；线粒体；线粒体凋亡；齐聚；小分子；电压依赖性阴离子通道（VDAC）。

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数字

图1。
图1。
监测VDAC1齐聚和抑制的BRET分析。 A、，示意图显示了VDAC1-荧光素酶（RLuc，一种发光酶）作为供体和VDAC1-GFP2（荧光团）作为受体之间的能量转移。只有当施主和受主在空间上接近或物理上相互作用时，才会发生能量转移。增强凋亡的化合物导致VDAC1齐聚，从而增强BRET2信号，尽管凋亡抑制剂抑制VDAC1的齐聚，因此降低BRET2的信号。荧光素酶底物DBC在分裂时发光，从而激发近端GFP2蛋白，从而产生BRET2信号。B、，DNDS抑制亚硒酸盐诱导的BRET2信号。表达hVDAC1 shRNA的T-REx细胞与编码rVDAC1-Rluc（0.1μg）和rVDAC1-GFP2（0.8μg）的质粒共同转染。用DNDS（200μ米，1小时）和亚硒酸盐（30μ米，3h）。给出了三个独立重复的代表。C、，T-REx细胞按照B类采集，与EGS交联，然后使用抗VDAC1抗体进行免疫印迹分析。VDAC1单体、二聚体和多聚体的位置(多种)显示。这个白色星号表示具有改性电泳迁移率的单体VDAC1，代表分子内交联单体VDAC 1。D、，NCI文库中12种最活跃的化合物对BRET2增强的抑制作用。在As处理的细胞中获得BRET2信号2O（运行）三(60 μ米3小时；紫色条)，亚硒酸盐（30μ米3小时；绿色条)，或STS（1μ米3小时；红色条)使用或不使用所示化合物进行预处理（10μ米，1小时）。结果以BRET信号的抑制百分比表示，对应于平均值±S.E(n个＝2），第页<0.05（*）。E中，BRET分析总结。在包含1468种化合物的NCI文库中，71种化合物能够抑制As处理诱导的BRET信号（30-100%）2O（运行）三、亚硒酸盐或STS（列表见表1）。这些抑制了As诱导的BRET2O（运行）三或亚硒酸盐或亚硒酸盐或STS（重叠区域）。71种化合物中的12种（见图2A类)能够抑制所有三种诱导物引发的BRET2信号(黄色的).
图2。
图2。
VDAC1齐聚抑制剂第一轮筛选的结构活性分析。 A、，NCI文库中VDAC1齐聚的12种最活跃抑制剂的化学结构。B、，药效团搜索应用于A类.介绍了药效团和四个锚定点(橙色，芳香点；紫色，氢键供体点；蓝色，氢键受体点；绿色，疏水点）。还介绍了导致药效团的六种定向活性化合物。
图3。
图3。
VDAC1齐聚抑制剂的第二轮筛选。 A、，HeLa细胞与从Diverchim（10μ米，1小时）。然后将细胞暴露于亚硒酸盐（30μ米3小时；灰色条)或顺铂（15μ米20小时；蓝色条)如图1图例所示，通过化学交联对VDAC1齐聚进行分析C、，和VDAC1二聚体水平被量化。结果以抑制百分比表示。这个红色方块指出在第3轮（基于药物化学的化合物设计）中选择用于分析的最有效的化合物。所示结果对应于平均值±S.E(n个＝3），第页<0.05（*）。B、，显示了VDAC1低聚作用的四种最具活性的抑制剂的化学结构。这个黄色背景突出显示了所有四个分子中相似的结构部分。C类和D、，HeLa细胞与所示化合物（20μ米，1小时），然后加入或不加入亚硒酸盐（30μ米，3小时）(C类)或顺铂（15μ米，20小时）(D类). 收集细胞，用EGS交联（300μ米，15 min），并使用抗VDAC1抗体进行免疫印迹分析。VDAC1单体、二聚体和多聚体的位置(多种)显示。这个白色星号对应于具有改性电泳迁移率的单体VDAC1，代表分子内交联单体VDAC 1。提供了分子尺寸蛋白质标准的位置。指出了分子来源（AKOS或Diverchim）。E中，VDAC1二聚体数量的定量分析C类和D类如图所示。灰色和蓝色条分别代表亚硒酸盐和顺铂的结果。数据以二聚体形成抑制百分比表示。所示结果对应于平均值±S.E(n个= 3),第页< 0.05(*).
图4。
图4。
AKOS-022抑制凋亡的程度与VDAC1齐聚的相关性。HeLa细胞与指示浓度的AKOS-022孵育2 h，然后与亚硒酸盐（30μ米，3小时）(A–C)或顺铂（15μ米，20小时）(B、 D、，和E类). 收集细胞并与EGS交联（300μ米，15分钟），并使用抗VDAC1抗体通过免疫印迹分析VDAC1齐聚(A类和D类)或使用annexin V-FITC/PI染色和FACS分析检测凋亡细胞死亡(B、 C、，和E类). 这个白色星号在里面A类和D类表示具有改性电泳迁移率的单体VDAC1，代表分子内交联单体VDAC 1。给出了具有代表性的FACS结果(B类). 亚硒酸盐对VDAC1二聚体水平和凋亡细胞（膜联蛋白阳性细胞）抑制作用的定量分析(C类)或顺铂(E类)作为AKOS-022浓度的函数呈现。结果反映了平均值±S.D(n个= 3).F、，细胞凋亡抑制程度与亚硒酸盐诱导VDAC1二聚体形成抑制作用的定量分析(■) 或顺铂(□), 在相同的AKOS-022浓度下进行分析。
图5。
图5。
化合物直接与纯化的VDAC1相互作用并降低通道活性。 A、，母体分子（AKOS-022）和两个新合成的分子（VBIT-3和VBIT-4）的化学结构。B、，将纯化的VDAC1重组为PLB，在添加40μ米AKOS-022、VBIT-3或VBIT-4。C、，VDAC1电导随电压变化的多通道记录，以及之前VDAC1的平均稳态电导(■) 添加AKOS-022后30分钟(○),VBIT-3型(□), 或VBIT-4(●). 相对电导(G公司/G公司o个，电导/最大电导）。根据−10 mV（最大电导）下的电导对数据进行归一化。D、，纯化VDAC1（133 n米)使用NanoTemper荧光蛋白标记试剂盒BLUE标记，与浓度增加的AKOS-022孵育(○),VBIT-3型(□), 或VBIT-4(●) (0.3–100 μ米). 培养20分钟后，将3-5μl样品加载到MST级玻璃毛细管中，并使用Monolith-NT115仪器测量热泳过程。结果表示为结合分数的%，计算如下：结合分数=100×(F类−F类最小值)/(F类最大值−F类最小值).E中，根据MST测量得出的测试化合物的VDAC1结合亲和力D类所示结果对应于平均值±S.D(n个= 3).F、，MST法显示VBIT-4与重组纯化VDAC亚型结合。○, ●, 以及□ 分别表示VDAC1、VDAC2和VDAC3的绑定。插入显示了所使用的纯化蛋白质的Commassie蓝染色。
图6。
图6。
受试化合物抑制亚硒酸诱导的VDAC1齐聚。 A、，将HEK-293细胞与指示浓度的AKOS-022、VBIT-3或VBIT-4孵育2 h，然后加入或不加入亚硒酸盐（15μ米，4小时），收获，与EGS交联（300μ米，15 min），并使用抗VDAC1抗体进行免疫印迹分析。指出了VDAC1单体和多聚体的位置。这个白色星号表示具有改性电泳迁移率的单体VDAC1，代表分子内交联单体VDAC 1。提供了分子尺寸蛋白质标准的位置。B、，定量分析不同化合物硒诱导的VDAC1二聚体形成，以抑制百分比表示。结果显示平均值±S.D(n个= 3).C、，利用annexin V-FITC/PI染色和FACS分析化合物对亚硒酸盐诱导的细胞凋亡的抑制作用。●, ○, 以及□ 分别表示VBIT-4、AKOS-022和VBIT-3。D、，细胞抑制c（c）亚硒酸盐诱导线粒体释放。评估细胞c（c）释放后，用0.025%洋地黄素将细胞在冰上培养10分钟，然后离心，得到颗粒(线粒体)和上清液(细胞溶质)进行SDS-PAGE和免疫印迹，使用抗细胞c（c），抗体。使用抗-VDAC1和抗GAPDH抗体验证细胞溶质提取物不含线粒体。E中，硒诱导细胞的定量分析c（c）被测化合物释放到胞浆中。数据以抑制百分比表示。所示结果对应于平均值±S.D(n个= 3). ●, ○, 以及□ 分别表示VBIT-4、AKOS-022和VBIT-3。F、，集成电路50值（μ米)从中衍生的化合物B、 C类、和E类所示结果对应于平均值±S.D(n个= 3).G、，VBIT-4和AKOS-022对STS诱导的细胞死亡具有保护作用。HEK细胞与VBIT-4或AKOS-022（15μ米2 h），然后用STS（0.2μ米，3小时）。通过吖啶橙和溴化乙锭染色分析凋亡细胞死亡。应该注意的是，STS使凋亡细胞发生碎裂，而FACS分析是有问题的。H、，VBIT-4对砷的影响2O（运行）三-诱导细胞死亡。HEK细胞与VBIT-4（15μ米，2 h），然后用As孵育诱导细胞凋亡2O（运行）三（16小时，30μ米). 细胞死亡分析采用PI染色和FACS分析。我，抑制亚硒酸盐诱导的HK-I从线粒体上脱落。为了评估HK-I脱离，将细胞作为D类并使用抗HK-I抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹。使用抗-VDAC1和抗GAPDH抗体验证细胞溶质提取物不含线粒体。上清液中HK的水平以亚硒酸盐诱导HK脱落的百分比表示（在计算未处理细胞中存在的细胞溶质HK数量后）。
图7。
图7。
VBIT-4及其对映体在抑制硒诱导的VDAC1齐聚和细胞死亡方面同样有效。 A、，VBIT-4两种对映体VBIT-4-1和VBIT-4-2的化学结构。B、，HEK-293细胞与VBIT-4、VBIT-4-1或VBIT-4-2（10μ米)持续2小时，然后加入或不加入亚硒酸盐（15μ米，4小时）。收集细胞，用EGS交联（300μ米，15 min），并使用抗VDAC1抗体进行免疫印迹分析。指出了VDAC1单体和多聚体的位置。这个白色星号表示具有改性电泳迁移率的单体VDAC1，代表分子内交联单体VDAC 1。使用PI染色和FACS分析测量细胞死亡，并在印迹底部显示。C、，HeLa细胞与指定浓度的受试化合物孵育1小时，然后与亚硒酸盐（25μ米，3小时）。收集细胞并使用PI染色和FACS分析检测细胞死亡。所示结果对应于平均值±S.D(n个= 3).
图8。
图8。
化合物抑制神经元细胞和Bax/Bak-lacking MEFs细胞中VDAC1齐聚和凋亡。 A类和B、，SH-SY5Y细胞与AKOS-022或VBIT-4（30μ米，2小时），然后加或不加顺铂（20μ米，20小时）。收集细胞，用EGS交联（200μ米，15分钟），并使用抗VDAC1抗体进行免疫印迹分析(A类)或细胞凋亡(B类)如使用膜联蛋白V-FITC/PI染色和FACS分析的。这个白色星号表示具有改性电泳迁移率的单体VDAC1，代表分子内交联单体VDAC 1。B、，顺铂诱导VDAC1二聚体形成的定量分析(灰色列)和凋亡(黑色列). 所示结果对应于平均值±S.D(n个= 3),第页< 0.001(***).C、 Bax公司−/−/贝克−/−MEF细胞与AKOS-022或VBIT-4（20μ米，2小时），然后加或不加顺铂（20μ米，20小时）。收集细胞，用EGS交联（200μ米，15分钟）。这个白色星号表示具有改性电泳迁移率的单体VDAC1，代表分子内交联单体VDAC 1。D、 Bax公司−/−/贝克−/−MEF细胞被视为C类并对细胞因子进行了评估c（c）释放。用0.025%洋地黄素在冰上培养细胞10分钟并离心(水户，线粒体）和上清液(细胞溶质)进行SDS-PAGE和免疫印迹，使用抗细胞c（c）抗体。使用抗-VDAC1和抗GAPDH抗体验证细胞溶质提取物不含线粒体。E中，顺铂诱导VDAC1二聚体形成的定量分析(灰色条)和细胞c（c）释放(黑色条). 所示结果对应于平均值±S.D(n个= 3),第页<0.01（**）或<0.001（***）。提供了分子尺寸蛋白质标准的位置。
图9。
图9。
硒的复合抑制作用导致细胞内钙和活性氧水平增加，线粒体膜电位降低。HEK-293细胞与AKOS-022或VBIT-4（15μ米，2小时），然后加入或不加入亚硒酸盐（15μ米，4小时）。A、，收获细胞，细胞内钙（[Ca2+]我)使用Fluo-4和FACS分析测量水平，并给出了代表性的FACS结果。结果的定量分析以最大百分比[Ca表示2+]我在底部。B、，采用TMRM和FACS分析线粒体膜电位（ΔΨm）。给出了典型的FACS结果。CCCP（25μ米，30 min）作为ΔΨm耗散的阳性对照，CCCP敏感的TMRM荧光被认为是100%，结果显示在底部。C、，用羧基-H分析细胞活性氧水平2-DCFDA和FACS分析，具有代表性的FACS结果和定量分析(底部)如图所示。D、，线粒体超氧化物用MitoSOX红和流式细胞术检测，具有代表性的FACS结果，并进行定量分析(底部)如图所示。结果如所示A–D对应于平均值±S.D(n个= 3),第页< 0.05 (*),第页<0.01（**），或第页< 0.001 (***).
图10。
图10。
总结了三轮化合物筛选以及VBIT-4和AKOS-022介导的细胞凋亡保护模式。 A、，先导化合物开发：我，BRET2对1468个小分子进行了首次筛选，鉴定出12种抑制VDAC1齐聚的化合物。二、，第二轮筛选34个分子，根据第一次筛选中确定的12种化合物进行筛选。筛选出四种对VDAC1齐聚反应有强烈抑制作用的化合物。三、，第三轮筛选针对13个基于第二轮筛选中确定的四种化合物设计的分子。确定了最有效的化合物AKOS-022。四、，AKOS-022用于设计和合成新型衍生物VBIT-3和VBIT-4。V、，VBIT-4对映体。B、，基于VDAC1的细胞凋亡模型及其VBIT-4和AKOS-022的抑制作用。凋亡刺激或病理条件导致VDAC1齐聚，形成凋亡蛋白释放途径(例如细胞c（c）和AIF）。VBIT-4和AKOS-022直接与VDAC1相互作用，并抑制其寡聚化、随后的HK脱落和线粒体膜间隙中凋亡蛋白的释放，从而抑制凋亡。
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