TSPAN8 Expression Distinguishes Spermatogonial Stem Cells in the Prepubertal Mouse Testis

doi:10.1095/biolreprod.116.144220

.2016年12月；95（6）:117。

doi:10.1095/biolreprod.116.144220。 Epub 2016年10月12日。

TSPAN8的表达区分青春期前小鼠睾丸中的精原干细胞

附属公司

¹德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学生物系。
²德克萨斯大学圣安东尼奥分校基因组学核心设施。
^三华盛顿州立大学兽医学院分子生物科学学院生殖生物学中心，华盛顿州普尔曼。
⁴北卡罗来纳州格林维尔市东卡罗来纳大学布罗迪医学院解剖与细胞生物学系和东卡罗来纳糖尿病与肥胖研究所。
⁵德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学生物系brian.hermann@utsa.edu。

PMID： 27733379
预防性维修识别码：项目编号：5315423
内政部： 10.1095/生物修复116.144220

TSPAN8的表达区分青春期前小鼠睾丸中的精原干细胞

卡萨迪·穆托吉等。生殖生物学. 2016年12月.

.2016年12月；95(6):117.

doi:10.1095/biolreprod.116.144220。 Epub 2016年10月12日。

附属公司

¹德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学生物系。
²得克萨斯州圣安东尼奥市得克萨斯大学基因组学核心设施。
^三华盛顿州立大学兽医学院分子生物科学学院生殖生物学中心，华盛顿州普尔曼。
⁴北卡罗来纳州格林维尔市东卡罗来纳大学布罗迪医学院解剖与细胞生物学系及东卡罗莱纳州糖尿病和肥胖研究所。
⁵德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学生物系brian.hermann@utsa.edu。

PMID： 27733379
预防性维修识别码：项目编号：5315423
内政部： 10.1095/生物制品116.144220

摘要

精原干细胞（SSC）与缺乏干细胞活性并致力于分化的祖精原细胞之间的精确分离仍然是一个挑战。为了区分这些精原细胞亚型，我们在出生后第6天小鼠睾丸的未分化精原细胞（包括Tspan8、Epha2和Pvr）中确定了在单细胞水平上显示双峰mRNA水平的基因，这些基因编码有助于细胞选择的细胞表面蛋白。移植研究提供了确凿的证据，证明TSPAN8-高亚群对SSC有富集作用。RNA-seq分析确定了TSPAN8-高亚群和-低亚群之间差异表达的基因，这些基因分别聚集在可能参与SSC更新或分化的多种生物途径中。甲基seq分析确定了这两个亚群中这些基因启动子中的低甲基化结构域，这些亚群与ChIP-seq分析定义的组蛋白修饰峰共定位。综上所述，这些结果表明了小鼠未分化精原细胞之间的功能异质性，并指出了区分SSC和祖精原细胞的关键生物学特征。

关键词：表观遗传学；单细胞；精原干细胞；表面标记；转录组；移植。

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图1
双峰mRNA丰度预测P6 ID4-EGFP亚群⁺未分化精原细胞。A类)基于单细胞qRT-PCR分析（数据来自[11]），小提琴图描绘了单个P6 ID4-EGFP精原细胞中mRNA丰度的双峰模式；原始出版物详细介绍了不显示双峰丰度的基因示例[例如。，*Ddx4型*,*达兹尔*,*伊特加6*,*Zbtb16号机组*]). 每个小提琴是一个直方图，显示每个复制细胞制备的对数转换Ct值（每个基因三个小提琴），其中每个表达水平（y轴）的宽度（x轴）表示具有该mRNA丰度的细胞的相对比例。图中显示了38个基因（共189个受检基因）的结果，这些基因显示了这种mRNA丰度的双峰模式。在编码细胞表面蛋白的10个双峰基因中，有7个（橙色标签条）缺乏用于流式细胞术的合适抗体，或者已经进行了研究（例如GFRA1、THY1），但可获得用于由*以法2*,*Pvr公司*、和*坦桑尼亚8*（蓝色标签栏）。B类)流式细胞术用于鉴定P6睾丸细胞中EPHA2、PVR和TSPAN8的抗体染色*Id4-eGfp*老鼠。密度点图显示顺序细胞预处理：细胞根据光散射特性（FSC-A×SSC-A；我)和生存能力（碘化丙啶阴性；**ii（ii）**).三和四)4%–5%的活单细胞呈EGFP阳性⁺外荧光（与*Id4-eGfp*-阴性同窝交配，未显示）。EGFP公司⁺精原细胞与同型对照抗体呈最小背景染色(三和四)或EPHA2抗体大量阳性染色(**v（v）**)、PVR(**不及物动词**)，或TSPAN8(**vii（七）**). 点表示单个细胞，蓝到红的色阶表示细胞数量/密度增加。记录了门和象限中的单元比例。

图2
ID4-EGFP的细胞周期状态⁺精原细胞亚群。A类)P6 ID4-EGFP之间的细胞周期状态⁺利用流式细胞仪和密度点图对亚群进行了表征，显示了基于以下光散射特性（FSC-A×SSC-A；我)，存活率（碘化丙啶阴性；**ii（ii）**)，单个单元格(三)和ID4-EGFP⁺(四). 用TSPAN8抗体染色的细胞(B类–D类)、EHPA2(E类–**G公司**)和PVR(**H（H）**–J)用Vybrant染料循环紫染色法进行DNA含量分析。显示了EGFP的细胞数量（y轴）和DNA含量（x轴）直方图⁺精原细胞的前三分之一（基于细胞数量）细胞染色最强烈**（B）**,E类、和H）和标记阳性细胞，其底部三分之一（基于细胞数量）的阳性染色强度最弱**（C）**,F类、和一）每个面板中的插图显示了带有EGFP强度、抗体染色强度和直方图选择门的点图。ID4-EGFP的百分比⁺每个直方图中显示的单元格都在直方图上方标注。每个直方图中的透明蓝色、红色和绿色曲线显示了对应于每个群体2N（G1/G0）、4>N>2（S）和（4N）G2/M分数的高斯函数，这些函数用于估计每个细胞周期阶段中选通细胞的比例。D类,**G公司**、和J）每个标记的四次重复染色实验结果的平均值±SEM显示在堆积条形图中。在每幅图中，Student确定了不同亚群之间细胞周期状态的显著差异t吨-测试，并在棒之间标记(**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01).

图3
TSPAN8的再生（SSC）活性^高和TSPAN8^低P6 ID4-EGFP的亚群⁺精原细胞。评估ID4-EGFP亚群中的SSC活性⁺P6处精原细胞*Id4-eGfp*x个*RosaLacZ公司*用TSPAN8抗体标记睾丸，并用TSPAN2标记睾丸^高和TSPAN8^低已排序(A类)通过输出导管注射用于SSC移植。显示了TSPAN8的典型X染色受体试验（移植后2–3个月）^高(**Bi公司**)和TSPAN8^低(**Bii公司**)P6 ID4-EGFP的亚群⁺精原细胞。C类)平均值±SEM菌落数（每10⁵细胞注射），从30个受体睾丸和4个重复的细胞分类实验显示。TSPAN8之间定植率的统计显著差异^高和TSPAN8^低P6 ID4-EGFP的亚群⁺精原细胞测定使用Studentt吨-测试(**P（P）*< 0.05).

图4
P6 ID4-EGFP的转录组特征⁺精原细胞和TSPAN8^高和TSPAN8^低亚群体。进行RNA-seq以进一步表征P6 ID4-EGFP⁺精原细胞及其亚群*Id4-eGfp*转基因睾丸。A类)FACS用于分离所有EGFP⁺或基于TSPAN8抗体染色的亚群。密度点图中显示了子种群的分类门。总EGFP⁺选择如图2A，iv所示*Id4-eGfp*睾丸细胞用于这些实验。B类)使用归一化基因表达数据结果进行无监督分层聚类，以检查样本之间的相似性。热图显示了平均表达量>2且最低的前500个基因的全球Z评分（参见图例量表）*P（P）*-显示了总ID4-EGFP的三个重复样本之间的比较调整值⁺（G1、G2、G3）和ID4-EGFP各重复三次⁺/TSPAN8公司^高（TH1、TH2、TH3）和ID4-EGFP⁺/TSPAN8公司^低（TL1、TL2、TL3）亚群。基因树状图（垂直）表示Ward连锁（欧几里德距离），样本树形图（水平）表示Spearman相关系数。显示每个ID4-EGFP的平均±SD mRNA水平（标准化表达计数）⁺未分化精原细胞标记基因的亚群(C类)泛生殖细胞与精原细胞分化标记基因(D类)和睾丸体细胞类型的标记(E类). 注意，y轴显示在Log中₁₀比例尺。统计上的显著差异(*P（P）*≤0.0001）在TSPAN8之间^高和TSPAN8^低在相邻的条形图对上方注明了亚群：A类（TSPAN8中的mRNA水平更高^高);B类（TSPAN8中的mRNA水平更高^低). <2的表达计数被认为是检测不到的。

图5
TSPAN8基因表达的差异^高和TSPAN8^低P6 ID4-EGFP的亚群⁺精原细胞。ID4-EGFP之间平均表达值>2的基因水平存在显著差异⁺/坦桑尼亚8^高和ID4-EGFP⁺/TSPAN8公司^低精原细胞种群。群体间水平存在统计显著差异的基因(*P（P）*<0.0001），ID4-EGFP之间的水平差异至少为2倍⁺精原细胞群体被认为是差异表达的。A类)TSPAN8之间的比较显示了顶部差异表达基因（折叠变化）^高和TSPAN8^低图描绘了每个ID4-EGFP的标记基因的平均±SD mRNA水平（标准化表达计数）⁺亚群。所有钢筋对都有显著差异(*P（P）*<0.0001）TSPAN8之间^高和TSPAN8^低亚群体。B类)仅使用差异表达基因的层次聚类用于确认单个样本重复和组差异表达基因之间的分离。显示了差异表达基因的全局Z评分热图，用于ID4-EGFP的三个重复之间的比较⁺/TSPAN8公司^高（TH1、TH2、TH3）和ID4-EGFP⁺/TSPAN8公司^低（TL1、TL2、TL3）亚群。这些差异表达基因的GO分析见表1和补充表S8。水平聚类（样本）基于欧氏距离（未显示树状图），垂直聚类（基因）基于斯皮尔曼相关系数。然后使用K均值聚类（六个聚类）对具有相似表达模式的基因进行分组。聚类标签（1-6）表示补充表S7中的基因组。集群的GO分析见补充表S10。注：补充图S5和补充表S9显示了mRNA丰度差异为1.5倍的平行分析。

图6
TSPAN8差异表达基因的表观遗传编程^高和TSPAN8^低亚群体。发现P6 ID4-EGFP的TSPAN8亚群之间具有显著不同的mRNA水平的基因⁺用全基因组测序方法对精原细胞进行DNA甲基化和翻译后组蛋白修饰分析。A类)减少代表性亚硫酸氢钠甲基-Seq用于分析来自任一合并TSPAN8的基因组DNA中约1700万CpG^高（横轴）或合并TSPAN8^低（纵轴）精原细胞。图中显示了启动子CpG甲基化在1 kbp窗口上的散点图，该窗口跨越了两个细胞群体中差异表达基因（距离TSS±0.5 kb）的转录起始位点（TSS）。CpG甲基化百分比（0%=未甲基化；100%=完全甲基化）通过对启动子窗口内检测到的任何CpG的甲基化状态进行平均来确定。共有12个基因在至少一个样本中未检测到CpGs，这些基因被排除在该图之外。虚线表示每个样品中50%的甲基化。每个点代表一个差异表达的基因启动子。在这两个群体中都有CpG甲基化数据的277个差异表达基因中，许多基因都是低甲基化的（238个基因，左下象限），一些基因在这两种精原细胞亚型中都是高甲基化（32个基因，右上象限）。极少数差异表达基因（7个基因）在其启动子区域显示出相应的DNA甲基化差异水平。B类)使用从TSPAN8中分离的染色质，显示了H3K4me3、H3K27ac和H3K17me3的以差异表达基因TSS为中心（±10 kbp）的堆叠ChIP-seq读取的热图^高（高）和TSPAN8^低（低）亚群。基因根据差异表达按簇进行分组，如图5所示。热图比例尺显示在右侧。C类和D类)直方图轨迹显示了示例性基因的ChIP-seq（H3K4me3、H3K27ac和H3K17me3；ChIP'd DNA丰度）和甲基seq（CpG甲基化，%5meC）结果。TSPAN8的结果^高（绿色或蓝色）和TSPAN8^低（红色）显示子种群，右侧显示样本身份。检测到的CpG在甲基色数据下方用黑色勾号表示。基因注释标注在轨迹下方（TSS=弯曲箭头；UTR=短条；编码外显子=高条）。灰度条=1 kbp。C类)显示了三种不同的组蛋白修饰模式：i）仅H3K4me3的峰（例如。，*A530072M11活塞*); ii）仅H3K27me3的峰值（例如。，*Aldh1a3型*); 和iii）H3K4me3和H3K27ac的同时峰值（例如。，*灰尘6*). 这两种精原细胞亚型中的每一种都存在于许多差异表达的基因中，无论该基因在哪个亚型中上调或下调。在每种情况下，组蛋白修饰的峰值与低甲基化启动子域共定位。D类)*Sox18系列*具有二价基因特征的H3K4me3和H3K27me3同时峰值的示例性基因；*Fam129c系列*是一个罕见的基因实例，该基因显示两种活性组蛋白修饰H3K4me3和H3K27ac的差异强烈峰值，这与该基因在两种精原细胞亚型中的差异表达水平相关，并且*Cyp11a1细胞*两种精原细胞亚型中均被抑制的例证基因，显示DNA超甲基化，启动子区无组蛋白修饰峰。

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[10] Busada JT，Geyer CB。维甲酸（RA）在精原细胞分化中的作用。生物繁殖。2016;94:10.-项目管理咨询公司-公共医学

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