Quantification and Characterization of UVB-Induced Mitochondrial Fragmentation in Normal Primary Human Keratinocytes

doi:10.1038/srep35065

.2016年10月12日6:35065。

doi:10.1038/srep35065。

UVB诱导正常人原代角质形成细胞线粒体碎片的定量和表征

罗曼·朱格^1 2, Josselin Breugnot公司², 塞利亚·达·席尔瓦¹, 西尔维·博德斯², 碧姬·克劳斯², 阿卜杜勒·奥瓦切里亚^1 三

附属公司

¹里昂高等师范学院细胞实验室分子生物学，UMR 5239 CNRS-UCBL-ENS里昂，46 Allée d’Italie，69364 Lyon Cedex 07，法国。
²SILAB，ZAC de la Nau，19240年，法国圣维昂斯。
^三ISEM-蒙彼利埃进化科学研究院，UMR 5554，蒙彼利尔大学| CNRS | IRD | EPHE，法国蒙彼利耶巴塔利隆广场，34095。

PMID： 27731355
预防性维修识别码：项目经理5059735
内政部： 10.1038/srep35065

UVB诱导的正常原代人角质形成细胞线粒体片段的定量和表征

罗曼·朱格等。科学代表. 2016.

.2016年10月12日6:35065。

doi:10.1038/srep35065。

作者

罗曼·朱格^1 2, Josselin Breugnot公司², 塞利亚·达·席尔瓦¹, 西尔维·博德斯², 碧姬·克劳斯², 阿卜杜勒·奥瓦切里亚^1 三

附属公司

¹里昂高等师范学院细胞实验室分子生物学，UMR 5239 CNRS-UCBL-ENS里昂，46 Allée d’Italie，69364 Lyon Cedex 07，法国。
²SILAB，ZAC de la Nau，19240 Saint-Viance，法国。
^三ISEM-蒙彼利埃进化科学研究院，UMR 5554，蒙彼利尔大学| CNRS | IRD | EPHE，法国蒙彼利耶巴塔利隆广场，34095。

PMID： 27731355
预防性维修识别码：项目经理5059735
内政部： 10.1038/srep35065

摘要

紫外线照射是导致皮肤干燥、衰老和癌症的主要环境因素。UVB尤其会引发累积DNA损伤、氧化应激和线粒体功能障碍。我们研究的目的是对健康供体正常人表皮角质形成细胞（NHEK）中线粒体对紫外线照射的反应进行定性和定量分析，其基本原理是，监测线粒体形状将显示细胞群适合性，并能够筛选具有UVB保护特性的生物活性剂。我们的结果表明，NHEK在暴露于UVB后经历了剂量依赖性线粒体断裂。为了定量测量这一现象，我们基于共焦显微镜和线粒体形状描述符的计算，实现了一种新的工具，用于自动量化活细胞中的线粒体形态。该方法用于证实UVB辐射对线粒体形态的影响以及击倒线粒体裂变介导GTPase动力蛋白相关蛋白1（DRP1）的影响。我们的数据进一步表明，所有主要线粒体动态蛋白都在NHEK中表达，但线粒体解偶联处理后其水平变化比UVB照射或DRP1敲除后更强。我们的系统和程序可能对化妆品或皮肤UVB保护剂的鉴定感兴趣。

PubMed免责声明

利益冲突声明

J.B.、S.B.和B.C.是SILAB S.A.的雇员。

数字

**图1。随着UVB剂量的增加，照射后NHEK线粒体形态的变化。**
(一)通过MitoTracker Green染色在未照射（对照组）或照射的NHEK和指示剂量的UVB中显示线粒体的代表性图像。使用活细胞共聚焦显微镜拍摄照片6 辐照后h。比例尺 = 20 微米。(b条)使用半手工方法量化线粒体形状描述符的圆度（顶部）和长宽比（底部）。每个条件下定量30个细胞。数据表示一个供体的三个单独实验，并表示为平均值 ± 标准偏差*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与使用t检验的对照（未照射）细胞相比。

**图2。单一亚毒性UVB剂量照射NHEK后线粒体形态的变化。**
(一)MitoTracker Green染色显示的非辐射（对照）或200 毫焦耳/厘米²中波紫外线。使用活细胞共焦显微镜拍摄照片6 辐照后h。比例尺 = 20 μm（放大倍数：比例尺 = 5 微米）。(b条)使用半手工方法量化线粒体形状描述符的圆度（顶部）和长宽比（底部）。每个条件下定量30个细胞。数据表示五个捐赠者的十三个单独实验，并表示为平均值 ± 标准偏差***p < 0.001与对照（未辐照）细胞相比。(**c（c）**)使用我们的自动化方法量化线粒体形状描述符圆度（左）和长宽比（右）(*米托沙佩*). 每个条件下至少有60个细胞被定量。数据表示五个捐赠者的六个单独实验，并表示为平均值 ± 标准偏差***p < 0.001与对照组进行t检验。

**图3。细胞溶质和线粒体部分DRP1蛋白的Western blot分析。**
代表性免疫印迹显示DRP1在线粒体富集的重膜（HM）和对照NHEK（−）或NHEK照射（+）200 毫焦耳/厘米²UVB用于6 h.注意，DRP1显示为双分子（但不是二聚体）。线粒体DRP1蛋白水平以对照的百分比表示。VDAC1作为线粒体标记物。数据表示四个捐赠者的四个单独实验，并表示为平均值 ± 标准偏差***p < 0.001与对照组进行t检验。分别使用抗VDAC1抗体、抗α-微管蛋白和抗HSP70抗体通过蛋白质印迹证实了重膜和胞质部分的纯度（补充图S8）。

**图4。敲除DRP1对NHEK细胞线粒体形态的影响。**
(一)显示NHEK中DRP1蛋白水平的代表性免疫印迹48 转染后h荧光素酶阴性对照siRNA或带有*DRP1（DRP1）*-特异性siRNA(b条)通过MitoTracker Green染色观察转染对照siRNA的NHEK线粒体形态的代表性图像和放大区域*荧光素酶*基因或带有siRNA-*DRP1（DRP1）*未经处理（对照）或用200 毫焦耳/厘米²中波紫外线。使用活细胞共焦显微镜拍摄照片6 辐照后h。比例尺 = 20 μm（放大倍数：比例尺=5 微米）。(**c（c）**)使用我们的自动化方法量化线粒体形状描述符圆度（顶部）和长宽比（底部）(*米托沙佩*). 每个条件下至少有60个细胞被定量。数据表示12个供体的12个单独实验，并表示为平均值 ± 标准偏差*p < 0.05，**p < 0.001，***p < 0.001，使用t检验。

**图5。UVB照射或DRP1敲除对线粒体动态蛋白水平的影响。**
(一)未经治疗的NHEK（对照组）和用10 μM CCCP或200辐照毫焦耳/厘米²UVB用于6 h.线粒体动态蛋白水平表示为对照组的百分比。VDAC1作为线粒体标记物。数据表示五个捐赠者的五个单独实验，并表示为平均值 ± 标准偏差*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与使用t检验的对照细胞相比。(b条)靶向NHEK的对照siRNA转染NHEK中的线粒体动态蛋白*荧光素酶*基因或带有siRNA-*DRP1（DRP1）*未经治疗（对照）或照射。数据代表了八个捐赠者的八个独立实验。请注意，MFF被发现以三种主要形式存在，以大约25、35和40的分子质量迁移千帕。OPA1的Western blot显示一个对应于OPA1-L和OPA1-S亚型的双重体。

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参考文献

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1. McBride H.M.、Neuspiel M.和Wasiak S.线粒体：不仅仅是一个强大的动力。当前生物学：CB 16，R551–R560，doi:10.1016/j.cub.2006.06.054（2006）。-内政部-公共医学
1. Kamat P.K.、Kalani A.、Kyles P.、Tyagi S.C.和Tiagi N.线粒体自噬：神经退行性疾病有希望的治疗靶点。《细胞生物化学和生物物理》70，707–719，doi:10.1007/s12013-014-0006-5（2014）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Saxton W.M.和Hollenbeck P.J.《线粒体的轴突运输》，《细胞科学杂志》125，2095–2104，doi:10.1242/jcs.053850（2012）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Nunnari J.和Suomalainen A.线粒体：在疾病和健康中。Cell 1481145–1159，doi:10.1016/j.Cell.2012.02.035（2012）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Nunnari J.和Suomalainen A.线粒体：在疾病和健康中。Cell 1481145–1159，doi:10.1016/j.Cell.2012.02.035（2012）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[3] McBride H.M.、Neuspiel M.和Wasiak S.线粒体：不仅仅是一个强大的动力。当前生物学：CB 16，R551–R560，doi:10.1016/j.cub.2006.06.054（2006）。-内政部-公共医学

[4] McBride H.M.、Neuspiel M.和Wasiak S.线粒体：不仅仅是一个强大的动力。当前生物学：CB 16，R551–R560，doi:10.1016/j.cub.2006.06.054（2006）。-内政部-公共医学

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[10] Saxton W.M.和Hollenbeck P.J.《线粒体的轴突运输》，《细胞科学杂志》125，2095–2104，doi:10.1242/jcs.053850（2012）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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