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.2016年10月4日；17（2）:596-608。
doi:10.1016/j.celrep.2016.09.018。

通过全基因组DNA甲基化谱研究间变性大细胞淋巴瘤的发病机制

梅兰妮·哈斯勒 1, 沃尔特·普勒 2, Ranjani Lakshminarasimhan先生 三, 伊丽莎·雷德尔 1, 朱莉娅·哈克 1, 加文·D·加兰 4, 奥拉夫·默克尔 5, 安娜·伊里斯·希弗 1, 英格丽德·西蒙尼施·克鲁普 1, 卢卡斯·肯纳 6, 丹尼尔·魏森伯格（Daniel J Weisenberger） 7, 安德烈亚斯·温豪塞尔 2, 苏珊·德特纳 8, 格尔达·艾格 9
附属公司

通过全基因组DNA甲基化谱研究间变性大细胞淋巴瘤的发病机制

梅兰妮·哈斯勒等。 单元格代表. .

摘要

恶性细胞中异常的DNA甲基化模式有助于深入了解肿瘤的演变和发展，并可用于疾病分类。在这里，我们描述了NPM-ALK阳性（ALK+）和NPM-ALK-阴性（ALK-）间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的全基因组DNA甲基化特征。我们发现，参与T细胞分化和免疫反应的基因（包括TCR和CTLA-4）的ALK+和ALK-ALCL具有共同的DNA甲基化变化，但对基因启动子中肿瘤DNA甲基化没有ALK特异性影响。此外，我们揭示了全球ALCL DNA甲基化模式与不同胸腺发育阶段的模式之间的密切关系，并观察到在富含保守转录因子结合基序（如AP1）的调控区域中肿瘤特异性DNA低甲基化。我们的结果表明，ALCL肿瘤细胞和胸腺T细胞亚群之间的相似性，以及ALCL致癌信号和DNA甲基化之间通过转录因子诱导和占据的直接关系。

关键词：DNA甲基化；NPM-ALK；间变性大细胞淋巴瘤。

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数字

图1
图1。ALCL与正常CD3的DNA甲基化+T细胞
（A） 维恩图显示了在ALK+、ALK-和正常CD3的比较中所示组之间的显著MVP（基于M值和调整后的p<0.01）+数字表示所选细分市场的唯一MVP；括号中的数字表示三组比较的MVP总数：ALK+与CD3+，ALK−与CD3+，以及ALK+与ALK−。（B） ALK+和对照T细胞之间检测到的31580个差异甲基化CpG位点的层次聚类（颜色键表示甲基化百分比，从红色=100%甲基化到绿色=0%甲基化）。样本注释：蓝色，肿瘤；黄色，正常CD3+; 红色，ALK+ALCL；绿色，ALK−ALCL。（C） 对照T细胞与ALK−ALCL中检测到的前5453个MVP的分层聚类（颜色键和样本注释如B所示）。（D） CD3之间MVP的数量和分布+在CpG岛周围的特定基因组区域和区域发现T细胞和ALK+或ALK-ALCL。低甲基化MVP显示在顶部；超甲基化MVP位于底部。筛选数据后获得不同的甲基化位点（筛选标准：调整后的p值<0.01，β值差异>|0.2|）。另请参见图S1和S2。
图2
图2。胸腺细胞与ALCL肿瘤细胞不同发育阶段的比较
（A） 左侧面板：胸腺T细胞亚群与ALK+和ALK-肿瘤细胞及外周CD3的主成分分析+T细胞（p<9.4e–6，q值=9.46e–4）。右侧面板：ETP的胸腺发育阶段（CD34+/CD1a公司−)至SP CD4+或CD8+细胞。（B） 胸腺亚群、ALK+和ALK-肿瘤细胞以及外周CD3的所有探针中前1%的探针的层次聚类+T细胞（4817个CpG位点）（p<9.4e-6，q值=9.46e-4）。如补充实验程序所述，使用Qlucore软件对数据进行标准化。使用全局归一化将每个样本的β值集中到平均值0（方差=1），以调整不同Infinium BeadChips的信号强度差异。颜色键从绿色=−2（0%甲基化）到红色=+2（100%甲基化）。
图3
图3。ALCL中T细胞特异性TF的沉默
（A） 胸腺T细胞发育的一系列阶段是由特定的TF驱动的。DN，双负极。（B） 与CD3相比，ALK+和ALK-ALCL之间指示TF的基因表达差异+T细胞。（C） 通过定量甲基化ms-qPCR测定28个ALK+ALCL、3个ALK−ALCL，15个AITL和18个PTCL-NOS肿瘤样本中指示基因启动子区域的DNA甲基化水平，以及6个健康CD3+样本作为对照。样本通过单因素方差分析（p<0.05）进行分析，然后使用未配对t检验与对照组进行配对比较。数值显示为平均值±SEM。另请参见图S3。
图4
图4。不同甲基化CpG位点的基因组和表观基因组特征
（A） 与CD3相比，使用ALK+和ALK-ALCL的高甲基化（红色）和低甲基化（绿色）CpG位点的指示基因组特征进行Epiexplorer分析+Illumina 450k阵列上所有CpG位点的T细胞（黑色）。（B） 检测到表观遗传转换HOXD公司在ESCs和GM12878淋巴母细胞中显示ChIP-seq占据H3K27me3和EZH2的区域，ALK+和ALK−ALCL中的簇。顶部轨迹（蓝色）：ALK+/ALK−ALCL与CD3的差异甲基化+T细胞。中间轨迹：加州大学圣克鲁斯分校（UCSC）基因注释轨迹，绿色方框表示CpG岛。下部轨迹：EZH2和H3K27me3在淋巴母细胞（红色）和ESCs（绿色）中富集。（C） ChIP询问抑制性组蛋白标记（H3K9me3，H3K27me3）和活性组蛋白标记HOXA9型和HOXD3型ALK+SU-DHL-1细胞中的基因启动子。GAPDH公司显示为活动区域的控件，SAT2标准为异色区的对照，NCR为阴性对照区的对照，以及PLAU公司是H3K27me3占用的控制阳性对照。H3global表示全球H3占用的控制ChIP。数值为平均值±SD。每个数值为三个重复的平均值。另请参见图S4。
图5
图5。DMR的特性
（A） 根据ALK+（左）和ALK-（右）与CD3+T细胞之间注释到不同基因组区域的所有CpG的平均β值计算的DMR识别（p值<0.05；β值差异≥0.15）。TSS包括TSS 200或1500 bp范围内的CpG。高甲基化DMR用红色表示；低甲基化DMR为绿色。（B） 使用DAVID网络工具进行GO术语分析。ALK+和ALK-肿瘤中显著的GO术语（校正后p<0.05）高度相似。（C） 具有差异甲基化启动子的基因与ALK+、ALK-ALCL和T细胞的基因表达谱的相关性。蓝色，ALCL与T细胞中基因下调；红色，ALCL与T细胞中的基因上调。高甲基化TSS，基因在其启动子内的两组中均显示较高甲基化；低甲基化TSS，两组启动子中甲基化程度较低的基因。另见表S1、S2和S3。
图6
图6。典型途径受不同甲基化基因的影响
（A） TCR通路的多个基因在ALK+和ALK−ALCL中被高甲基化（红色，显著地高甲基化基因；绿色，显著地低甲基化基因，调整后的p值<0.05；β值差异≥0.15）。该途径是通过使用QIAGEN的IPA生成的。（B） 与AP1共有基序相比，ALK+和ALK−ALCL中与低甲基化CpG相邻区域的无偏基序搜索（顶部）确定的DNA序列基序（底部）。（C） 具有假定AP1结合位点的低甲基化ALCL启动子的JUNB占用的ChIP。PDGFRβ，阳性对照。ChIP在3′端归一化为阴性对照区血小板衍生生长因子受体β；不含AP1基序的基因。数值为平均值±SEM。每个数值为三个重复的平均值。另请参见图S5-S8。
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