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.2016年8月4日；1（12）：e87732。
doi:10.1172/jci.insight.87732。

消除p19农业研究基金-表达细胞增强小鼠肺功能

桥本敏弘 1, 阿祖萨·阿塞 1, Hiroyuki Kawagishi先生 1, 三川龙田 1, 岩田裕二 1, Kazuki Kanayama公司 2, 杉本和司 3, 佐藤忠志 4, 三雄丸山 1, 杉本正太郎 1
附属公司

消除p19农业研究基金-表达细胞增强小鼠肺功能

桥本敏弘等。 JCI洞察力. .

摘要

随着动物年龄的增长，衰老细胞在许多组织中积累，并被认为是一些与衰老相关的病理学的基础。抑癌基因p19农业研究基金和第16页INK4a公司，两者都编码在CDKN2A型基因座在诱导和维持细胞衰老过程中的永久性细胞周期阻滞中起着关键作用。尽管p16的消除INK4a公司-表达细胞延长了小鼠的寿命，尚不清楚是否通过消除衰老动物的衰老细胞来恢复组织功能，以及p19是否以及如何恢复农业研究基金导致组织老化。衰老相关的肺功能下降的特征是顺应性增加以及对肺部疾病的致病易感性增加。我们在此证明，通过消除p19，12月龄小鼠的肺功能得到了可逆恢复农业研究基金-表达细胞。p19的消融农业研究基金-使用毒素受体介导的细胞敲除系统表达细胞可改善阿金相关的肺功能减退。此外，p19被消除后，aging-相关基因表达谱被逆转农业研究基金我们的结果表明，阿金相关的肺功能下降至少部分归因于p19农业研究基金并通过消除p19而恢复农业研究基金-表达细胞。

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数字

图1
图1。ARF-DTR转基因小鼠的建立。
(A类)使用噬菌体人工染色体构建转基因载体，包括一只小鼠INK4a/ARF型基因座。农业研究基金外显子1β被编码白喉毒素受体（DTR）的基因取代（人类HB-EGF公司I117V/L148V）融合到自切割小RNA病毒衍生的2A肽序列和萤火虫荧光素酶（DTR-Luc）。(B和C类)从野生型或ARF-DTR小鼠制备的MEFs在3T3方案上培养(B)或感染对照（puro）或致癌RasVal12-编码逆转录病毒(C类)以诱导衰老。用嘌呤霉素筛选感染细胞3天。制备细胞裂解物并测量荧光素酶活性。荧光素酶活性根据每个样本中的细胞数进行标准化。数值代表三份样品的平均值±SD。p19的表达证实了衰老农业研究基金，第16页INK4a公司第5段中的p21（P5）和Ras-expressing（Val12-expressing）MEF。Lamin A/C用作加载控制。(D类和E类)ARF-DTR MEF通过连续传代诱导衰老(D类)或致癌Ras(E类). 然后用指示浓度的白喉毒素（DT）处理MEF 24小时，并进行荧光素酶分析。数据是两个独立实验的代表。数值显示为三份样品的平均值±SD。(F类和G公司)ARF-DTR MEF通过连续传代诱导衰老(F类)或致癌Ras(G公司). 衰老MEF（P5或Ras）在无DT或有DT（1μg/ml）的情况下培养24小时，p19的表达农业研究基金和第16页INK4a公司免疫印迹分析。使用Lamin A/C作为负载控制。
图2
图2。在12个月大的ARF-DTR转基因小鼠中检测到荧光素酶信号。
(A类)将D-荧光素（150 mg/kg体重）腹腔注射到2个月或12个月大的雌性ARF-白喉毒素受体（ARF-DTR）或12个月中大的雌性野生型小鼠。注射荧光素10分钟后，进行体内成像分析，以检测3分钟暴露的发光。注射前将小鼠剃毛。(B)从指定年龄的野生型小鼠肺和性腺周围脂肪组织中提取总RNA。自动射频和INK4a公司mRNA水平通过实时PCR进行分析，并归一化为18S rRNA水平。数值代表至少3个独立实验的平均值±SEM。(C类)在腹腔注射白喉毒素（DT）前（左）和2天后（右），监测12个月龄雌性ARF-DTR小鼠的荧光素酶活性。红色圆圈中的信号表示肺组织荧光素酶活性。(D类)将荧光素腹膜内注射到用DT治疗或未治疗的12个月大的雌性ARF-DTR小鼠中3天。10分钟后，处死小鼠并进行剖腹手术，并分析体内荧光素酶活性。将显示灯光图像（左侧）和叠加图像（右侧）。卢，肺；Ad，脂肪组织。显示了3个独立实验的代表性图像。
图3
图3。荧光素酶在老年ARF-DTR小鼠肺泡成纤维细胞中表达。
(A类)肺细胞分离。支气管肺泡灌洗液（BAL）最初从肺部获得，主要含有巨噬细胞。将剩下的组织切碎，用胰蛋白酶消化，然后播种在组织培养皿上。孵育1小时后，收集含有上皮细胞的漂浮细胞。用胰酶消化附着细胞以恢复肺泡成纤维细胞。(B)从收集的细胞制备裂解物，并进行荧光素酶分析。荧光素酶活性根据每个样本中的细胞数进行标准化。给出了两个独立实验的结果。(C类-E类)ARF-白喉毒素受体（ARF-DTR）肺的免疫荧光染色。切片用所示蛋白的抗体染色。原始放大倍数，×40(C类和D类), ×100 (E类); 比例尺：20μm(C类和D类)，10微米(E类). (F类)ARF-DTR肺的免疫荧光染色。切片与表面活性剂相关蛋白C（SP-C）或ER-TR7成纤维细胞标记物以及荧光素酶共同染色。切片用DAPI复染。原始放大倍数，×100；比例尺：10μm。(G公司)统计SP-C或ER-TR7染色细胞中的荧光素酶阳性群体。每个切片中至少分析100个SP-C或ER-TR-7阳性细胞。数值代表3个独立实验的平均值±SEM。未检测到N.D。(H（H）)CD31的选通策略–；CD45型–；EpCAM公司+上皮细胞和CD31–；CD45型–；Sca-1型+间充质细胞。来自7只ARF-DTR小鼠的肺细胞在分选之前被汇集。(我)图中所示的门控上皮细胞和间充质细胞中测定了荧光素酶活性(H（H）). 荧光素酶活性根据每个样本中的细胞数进行标准化。给出了两个独立实验的代表性结果。数值代表三份样品的平均值±SD*P（P）<0.05，未配对学生t吨测试。
图4
图4。通过消除p19下调衰老基因农业研究基金-表达细胞。
(A类)实验设计。将12个月龄雌性野生型或ARF-白喉毒素受体（ARF-DTR）小鼠腹腔注射白喉毒素（DT）或PBS两次，间隔2周。第二次DT注射两周后，处死小鼠并分析其肺部。(B)使用活体成像软件测量ARF-DTR小鼠肺区的荧光素酶信号。数值代表独立实验的平均值±SEM。(C类和D类)从2个月龄和12个月龄ARF-DTR雌性小鼠的肺部提取总RNA，这些小鼠接受DT治疗或不接受DT 4周(C类)或12个月大的野生型小鼠接受或不接受DT治疗4周(D类). 的表达式农业研究基金,INK4a公司、和p21基因通过实时PCR进行分析。mRNA水平标准化为GAPDH公司在每个鼠标中。数值代表独立实验的平均值±SEM。数据进行单因素方差分析，然后进行事后Tukey-Kramer多重比较试验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图5
图5。通过消除p19恢复肺功能农业研究基金-表达细胞。
(A类)如图4A所示，ARF-白喉毒素受体（ARF-DTR）和用白喉毒素（DT）或PBS治疗的野生型小鼠肺的压力-体积曲线。对指定组的小鼠实施安乐死，并通过气管连接到FlexiVent系统。对小鼠进行剖腹手术，并在化验前取出膈膜。(B)静态肺顺应性（Cst）根据压力-容积环路的斜率计算。Cst反映了在给定肺容量下肺的静态弹性反冲压力。(C类–F类)动态肺顺应性(C类)，动态肺阻力（Rrs）(D类)，组织弹性（H）(E类)和组织阻尼（G）(F类)如图所示。动态肺顺应性捕捉肺可以伸展的容易程度，而动态肺弹性捕捉肺的弹性刚性或刚度。组织弹性和组织阻尼分别反映肺泡的能量守恒和耗散。数值代表独立实验的平均值±SEM。数据进行单因素方差分析，然后进行事后Tukey-Kramer多重比较试验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图6
图6。p19的影响农业研究基金-在肺形态上表达细胞清除。
(A类)如图4A所示，用白喉毒素（DT）或PBS治疗小鼠。肺组织用Bouin溶液固定在25 cmH2O并进行间苯二酚-品红染色，然后用苏木精-伊红进行复染。原始放大倍数，×120（使用数字变焦）；比例尺：20μm。(B和C类)肺泡平均线性截距(B)和隔壁厚度(C类)进行了测量。每只小鼠的肺泡数超过400个，间隔壁150个。(D类)肺切片的弹性蛋白免疫染色图像。肺切片用抗弹性蛋白进行免疫染色，并用HRP结合二级抗体进行可视化。在相同条件下对每个样本进行免疫染色。原始放大倍数，×40。(E类)通过ImageJ分析捕获的弹性蛋白免疫染色图像，以定量每个场的弹性蛋白信号。数值代表独立实验的平均值±SEM。数据进行单因素方差分析，然后进行事后Tukey-Kramer多重比较试验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图7
图7。DT治疗对老年小鼠的影响。
(A类)实验设计。将20至22个月大的雌性ARF-白喉毒素受体（ARF-DTR）或野生型小鼠腹腔注射白喉毒素（DT）或PBS两次，间隔2周。第二次注射DT两周后，处死小鼠并分析其肺部。(B)在DT治疗前后监测ARF-DTR小鼠的荧光素酶活性。(C类)DT或PBS处理的小鼠肺的压力-体积曲线(D类–G公司)静态肺顺应性（Cst）、动态阻力（Rrs）、动态顺应性（Crs）和组织阻尼（G）。(H（H）)PBS和DT处理小鼠的肺部图像。切片进行间苯二酚-富辛染色，然后用苏木精-伊红染色进行复染。原始放大倍数，×120（使用数字变焦）；比例尺：10μm。(我)PBS和DT处理小鼠的肺泡平均线性截获。数值代表独立实验的平均值±SEM*P（P）<0.05，未成对学生t吨测试。
图8
图8。DT治疗肺中衰老相关基因表达的变化。
(A类)从2个月龄和12个月龄雌性ARF-白喉毒素受体（ARF-DTR）小鼠肺组织中提取总RNA。如图4A所示，用PBS或白喉毒素（DT）治疗12个月大的小鼠。实时PCR分析所示基因的表达。mRNA水平标准化为GAPDH公司每个样本中的mRNA。数值代表平均值±SEM(B)野生型MEF感染了编码shRNA对抗MMP-10的逆转录病毒。使用两个独立的shRNA敲低MMP-10。每组均使用杂乱短发夹（sh-SCR）作为对照。感染细胞用嘌呤霉素筛选3天，暴露于电离辐射（10Gy），并在3%氧气条件下培养10天。免疫印迹法检测MMP-10的表达。Lamin A/C用作加载控制。(C类)对shRNA感染的衰老MEF进行弹性蛋白含量分析。在MMPs的化学抑制中，衰老的MEF在MMP抑制剂[N-异丁基-N-（4-甲氧基苯基磺酰基）-甘氨酰羟肟酸{NNGH}]存在下培养。每3天更换一次培养基。测量弹性蛋白的量，然后将其归一化为每个样品中的总蛋白质含量。数值表示一式三份样品的平均值±标准差。数据是两个独立实验的代表。对数据进行单因素方差分析，然后进行事后Tukey-Kramer多重比较测试（用于3组的比较）或未配对的Student’st吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图9
图9。p19的影响农业研究基金-表达对肺组织中衰老相关基因表达的细胞消除。
如图4A所示，在分析之前，用PBS或白喉毒素（DT）治疗12个月大的小鼠4周。每组有四只小鼠进行独立分析，并用平均值绘制热图。从列表中减去对DT无特异反应的基因。用于绘制热图的基因列于补充表1。基因的完整列表可从GEO数据库中获得（登录GSE64754）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001
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    1. Ben-Porath I，Weinberg RA。激活细胞衰老的信号和途径。国际生物化学与细胞生物学杂志。2005;37(5):961–976. doi:10.1016/j.bicel.2004.10.013。-内政部-公共医学
    1. 谢尔CJ。ARF和p53离婚：一个悬而未决的案例。Nat Rev癌症。2006;6(9):663–673. doi:10.1038/nrc1954。-内政部-公共医学
    1. Muñoz-Espín D等人。哺乳动物胚胎发育期间的程序性细胞衰老。细胞。2013;155(5):1104–1118. doi:10.1016/j.cell.2013.10.019。-内政部-公共医学
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