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.2016年10月：12:280-294。
doi:10.1016/j.ebiom.2016.09.06。 Epub 2016年9月10日。

Smad3小鼠结缔组织重构缺陷通过干扰下游TGF-β信号传导加速动脉瘤生长

范德普洛伊姆 1, N van Vliet公司 2, J H von der Thusen先生 三, J L罗伯特斯 三, Y里德万 2, 范海宁根 4, B S范泰尔 5, M Vermeij先生 2, S E曲棍球 6, R M G B建筑管理员 7, H J M Verhagen先生 8, R卡纳尔 9, A M贝托利·阿维拉 7, J埃塞斯 10
附属公司

Smad3小鼠结缔组织重构缺陷通过干扰下游TGF-β信号传导加速动脉瘤生长

范德普洛伊姆等。 EBioMedicine公司. 2016年10月.

摘要

动脉瘤-骨关节炎综合征的特征是不可预测的主动脉瘤形成，是由SMAD3突变引起的。SMAD3是SMAD2/3/4转录因子的一部分，对TGF-β激活的转录至关重要。虽然TGF-β相关基因突变会导致动脉瘤，但其潜在机制尚不清楚。在这里，我们检查了Smad3中动脉瘤的形成和进展-/-动物。Smad3公司-/-动物迅速发展为主动脉瘤，导致过早死亡。主动脉壁免疫组织化学显示，细胞外基质和胶原积累没有增加，血管平滑肌细胞（VSMC）也没有丢失，但显示了内侧弹性蛋白断裂和外膜炎症。值得注意的是，基质金属蛋白酶（MMPs）在血管平滑肌细胞中没有被激活，而是在炎症区域被特异性激活。尽管Smad3-/-主动脉显示细胞核pSmad2和pErk增加，表明TGF-β受体激活，下游TGF-α激活的靶基因没有上调。动脉瘤前Smad3中pSmad2和pErk染色增加-/-主动脉提示主动脉损伤和TGF-β受体激活信号先于主动脉炎症。最后，下游TGF-β激活的转录受损导致Smad3增加-/-VSMC增殖。Smad3缺乏导致下游基因的不平衡激活，VSMC中MMPs无激活，免疫反应导致主动脉壁快速扩张和破裂。我们的发现揭示了治疗SMAD3患者的新可能性；免疫抑制可能比靶向TGF-β信号更有益。

关键词：动脉瘤；超声心动图；小鼠模型；TGF-β信号通路；血管生物学。

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数字

图1
图1
动脉瘤增大和早期死亡Smad3公司−/−老鼠。a） B型超声图像Smad3公司−/−雌性小鼠及其Smad3公司+/+室友，6周大，图示主动脉直径测量。绿线表示心脏，红线表示主动脉，黄线表示测量点。b） 主动脉直径、c）主动脉根部和d）主动脉长度的量化Smad3公司+/+雄性（分别为10、10和8）、雌性（分别为9、9和8）和Smad3公司−/−6周龄时，男性（分别为10、10和6岁）、女性（分别为8、7和7岁）（分别为p<0.05、**p<0.001）。e） 的存续Smad3公司−/−与相比Smad3公司+/+老鼠。Smad3公司−/−女性（n=29）和男性（n=18）的生存率严重下降（分别为p<0.05和0.001）。f） 女性的代表性宏观图片Smad3公司−/−（右）和Smad3公司+/+同窝（左）主动脉，4个月大，明显显示主动脉巨大扩张Smad3公司−/−然而，胸主动脉壁具有与其相同的半透明性Smad3公司+/+控件。g） 代表性HE染色（左）Smad3公司−/−主动脉瘤，年龄4个月，显示血管壁破裂，与之相比Smad3公司+/+控制。阿尔西安蓝染色（中间）Smad3公司−/−主动脉在培养基中的ECM与Smad3公司+/+主动脉。苦味酸红染色法检测胶原沉积Smad3公司−/−和Smad3公司+/+主动脉无差异。每组观察n=8。Bar=50μm，m=中膜，a=外膜，lu=管腔。
图2
图2
动脉瘤快速生长Smad3公司−/−小鼠，不限于主动脉。a） 描述Smad3公司−/−18周前的小鼠，以及可能的原因（ND：未确定）。b） 描述主动脉直径的图表Smad3公司−/−雌性（左侧，n=4）和Smad3公司−/−雄性（右侧，n=3）。c） B型超声图像Smad3公司−/−雌性小鼠及其同窝小白鼠的主动脉直径在12周内大幅增加。绿线表示心脏，红线表示主动脉。d） 典型的CT图片Smad3公司−/−女性（右）及其Smad3公司+/+室友（左），4个月大，正面和侧面。箭头表示主动脉瘤的正面视图（白色）、颈静脉增大（黄色）和下腔静脉（蓝色）Smad3公司−/−鼠标。相同的站点显示在Smad3公司+/+动物。骨骼异常，如后凸，在Smad3公司−/−鼠标。
图3
图3
动脉瘤Smad3公司−/−主动脉显示免疫反应增强、弹性蛋白破坏、pSmad2和pErk激活。a） HE染色Smad3公司−/−主动脉瘤显示血管壁破裂、外膜炎症和囊性间隙（以*表示）。b） CD31染色显示了内皮层（箭头所示），也显示了观察到的囊性空间的排列（示例用*表示），表明这些空间代表外膜中的血管。c） 间苯二酚-品红染色显示动脉瘤中层弹性蛋白结构被破坏Smad3公司−/−与相比Smad3公司+/+主动脉。d） 动脉瘤平滑肌肌动蛋白染色Smad3公司−/−主动脉壁显示，与Smad3公司+/+e）pSmad2和f）pErk在动脉瘤的主动脉壁中染色增强Smad3公司−/−与相比Smad3公司+/+老鼠。这表明TGF-β受体活化增加。每组观察n=8，年龄为3-4个月。Bar=50μm，m=中膜，a=外膜，lu=管腔*；囊腔，箭头；内皮层。
图4
图4
动脉瘤中炎症相关MMP激活Smad3公司−/−老鼠。a） 代表体内男性形象Smad3公司−/−和Smad3公司+/+主动脉显示类似的基质金属蛋白酶激活。b） 代表体外男性形象Smad3公司−/−和Smad3公司+/+主动脉显示类似的基质金属蛋白酶激活。c） 荧光信号定量是MMP活性的一种测量方法，在Smad3公司−/−和Smad3公司+/+主动脉。每个的值Smad3公司−/−主动脉和它的Smad3公司+/+室友。男性和女性主动脉均用于量化（共8条）。这两个Smad3公司−/−相对荧光强度最高的主动脉也有动脉瘤。d） 男性活体外图像Smad3公司−/−动脉瘤患者的主动脉偶尔确实显示MMP激活增加。e） 动脉瘤中MMP9、T细胞（CD3）和巨噬细胞（MAC2）的免疫组织化学染色Smad3公司−/−主动脉壁，显示MMP9信号来自免疫细胞而非VSMC（每组5-7只动物，年龄3-4个月）。bar=100μm，m=中膜，a=外膜，lu=内腔。
图5
图5
动脉瘤前Smad3公司−/−动物表现出弹性蛋白破坏、pSmad2和pErk活化。a） 动脉瘤前病变的HE染色Smad3公司−/−主动脉显示内侧层VSMC的外观改变。b） 动脉瘤前平滑肌肌动蛋白染色Smad3公司−/−主动脉壁在中膜中没有明显的VSMC丢失，与Smad3公司+/+主动脉。c） Resorcin Fuchsin弹性蛋白染色显示动脉瘤前内侧层的弹性蛋白结构有所破坏Smad3公司−/−主动脉与Smad3公司+/+.d）动脉瘤前病变的主动脉壁中pSmad2染色已经有所增加Smad3公司−/−与相比Smad3公司+/+老鼠。e） pErk清楚地显示动脉瘤前病变主动脉壁的染色增强Smad3公司−/−与相比Smad3公司+/+老鼠。每组观察n=5，年龄为3-4个月。Bar=50μm，m=中膜，a=外膜，lu=管腔。
图6
图6
Smad3公司−/−VSMC和主动脉没有TGF-β信号的下游转录激活。a） 图片显示Smad3公司+/+和Smad3公司−/−经SMA染色证实，从主动脉中分离出VSMC。VSMC和主动脉mRNA的实时PCR分析显示b）Fn-1、c）Pai-1、d）Smad7和e）Smad6的mRNA水平下调Smad3公司−/−VSMC和主动脉提取物与Smad3公司+/+。显示了折叠更改Smad3公司−/−相对于Smad3公司+/+，*p<0.05，**p<0.01。显示了三个独立实验平均值的平均值，每组n=9–12。
图7
图7
增加Smad3公司−/−TGF-β诱导的转录活性降低导致VSMC增殖。a） KI67染色Smad3公司−/−主动脉壁显示内侧层VSMC增殖增加。b） 曲线描绘了Smad3公司−/−VSMC（开放符号）与Smad3公司+/+（闭合符号）。在y轴上，显示了与实验第1天的细胞相比，细胞的相对百分比。c） Erk、pErk和负载控制β-catenin的Western blotSmad3公司−/−,Smad3公司+/+,纤维蛋白-4+/+和纤维蛋白-4R（右）/R（右）VSMC蛋白提取物（左）。定量（β-catenin水平校正）显示Smad3公司−/−和纤维蛋白-4R（右）/R（右）VSMC相对于野生型（右）。d） 基于萤光素酶TGF-β转录的测定显示Smad3公司−/−VSMC相对于Smad3公司+/+，没有变化纤维蛋白-4R（右）/R（右）VSMC与纤维蛋白-4+/+显示了与野生型相比的相对荧光素酶信号，并对转染效率进行了校正。用三个独立的细胞系进行的实验。Luc=荧光素酶，Ren=肾素。
图8
图8
动脉瘤形成的比较以及两组之间TGF-β信号转导的差异模型纤维蛋白-4和Smad3公司VSMC不足。a） 动脉瘤形成与纤维蛋白-4和Smad3公司缺乏动物。b） 正常情况下，TGF-β受体被TGF-？配体（橙色菱形）激活，导致Smad2（pSmad2）磷酸化，与Smad3复合，转位到细胞核并诱导转录反应（左）。其中一个转录的基因是Smad7，它是上游TGF-β受体信号的一种有效抑制剂，因此提供了一个调节性负反馈回路。在纤维蛋白-4缺乏的情况下，更多TGF-β配体从基质中释放，导致TGF-？受体刺激和Smad2磷酸化增加，导致下游转录激活增加（右）。在Smad3公司缺乏细胞TGF-β受体仍能被TGF-α配体激活，Smad2仍能被磷酸化。然而，由于Smad3的缺失，Smad2/3复合物不会一起转移到细胞核，因此不会激活正常的下游转录程序。在Smad7和TGF-β的情况下，这会导致表达减少。由于Smad7是TGF-β信号通路的有效抑制剂，当缺失或减少时，TGF-。这可能导致在Smad3公司VSMC缺陷（中间）。
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