Forkhead Box O3A (FOXO3) and the Mitochondrial Disulfide Relay Carrier (CHCHD4) Regulate p53 Protein Nuclear Activity in Response to Exercise

doi:10.1074/jbc.M116.745737

.2016年11月25日；291(48):24819-24827.

doi:10.1074/jbc。M116.745737。 Epub 2016年9月29日。

叉头盒O3A（FOXO3）和线粒体二硫接力载体（CHCHD4）调节运动后p53蛋白核活性

杰庄¹, 威廉·M·坎普¹, 李杰（音译）¹, 刘成宇², Ju-Gyeong Kang公司¹, 王平远（音）¹, 保罗·M·黄^三

附属公司

¹来自分子医学中心和。
²转基因核心，NHLBI，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院，邮编：20892。
^三来自分子医学中心hwangp@mail.nih.gov。

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叉头盒O3A（FOXO3）和线粒体二硫接力载体（CHCHD4）调节运动后p53蛋白核活性

杰庄等。生物化学杂志. 2016.

.2016年11月25日；291（48）：24819-24827。

doi:10.1074/jbc。M116.745737。 Epub 2016年9月29日。

作者

杰庄¹, 威廉·M·坎普¹, 李杰（音译）¹, 刘成宇², Ju-Gyeong Kang公司¹, 王平远（音）¹, 保罗·M·黄^三

附属公司

¹来自分子医学中心和。
²转基因核心，NHLBI，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院，邮编：20892。
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摘要

虽然运动与改善健康有关，但其各种益处背后的具体分子机制需要进一步阐明。我们在这里报道，运动通过急性下调卷曲-螺旋-螺旋-卷曲-卷曲螺旋结构域4（CHCHD4）增加了p53的核定位和活性，CHCHD4－是一种介导p53导入线粒体的载体蛋白。这种运动反应在具有CHCHD4.组成性表达的转基因小鼠中消失。从机制上讲，运动诱导的核转录因子FOXO3与CHCHD4启动子结合并抑制其表达，阻止p53向线粒体移位，从而增加p53核定位。运动对核p53和FOXO3协同增加可以促进其在NAD反式激活Sirtuin 1（SIRT1）中已知的相互作用⁺-依赖性组蛋白去乙酰化酶，调节对各种应激的适应。因此，我们的结果揭示了一种机制，通过这种机制，运动可以预防癌症和其他与衰老相关的潜在疾病。

关键词：FOXO；运动；线粒体；线粒体转运；p53基因。

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数字

**图1。**
**CHCHD4调节p53亚细胞定位和核活性体内.** A类CHCHD4共聚焦免疫荧光图像(绿色)WT和CHCHD4-Tg小鼠骨骼肌横截面的表达。细胞色素的免疫荧光标记*c（c）*氧化酶亚基4（COX4）(红色)和Hoechst 33342(蓝色)染色分别作为线粒体和核标记物。B类CHCHD4和p21在WT和CHCHD4-Tg小鼠骨骼肌中的mRNA和蛋白表达。n个≥ 4.C类，p53调节WT和CHCHD4-Tg小鼠骨骼肌线粒体生物发生基因的mRNA表达。n个≥4。D类，相对mRNA表达（Tg与通过筛选骨骼肌中的RT-PCR阵列分析p53调节基因的WT）。n个≥ 4.E类线粒体中p53蛋白的比较(米托)用阿霉素治疗18小时的WT和CHCHD4-Tg小鼠骨骼肌和肝脏的核部分。VDAC和组蛋白H3(*历史。H3级*)分别作为线粒体和核蛋白负荷控制。所示为用于量化的四个独立实验的代表性免疫印迹图像。数值为平均值±S.E.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.比例尺=20微米。

**图2。**
**运动降低CHCHD4表达，增加p53核定位和活性。** A类未运动对照状态下WT小鼠骨骼肌CHCHD4和PGC-1α的相对mRNA水平(*CTL公司*)并在规定的时间点进行次最大强度跑步机运动60分钟后(*运动后*).底部面板运动后12 h骨骼肌线粒体CHCHD4蛋白及其底物TIMM9的免疫印迹（+），与未运动对照组相比（-）。VDAC起到线粒体蛋白质负荷控制的作用。n个= 3.B类未运动对照组和运动后WT组骨骼肌中相对p21 mRNA水平（p53^+/+)和p53^−/−老鼠。*底部面板*与未运动对照组相比，运动后12h（+）肌肉p21蛋白的免疫印迹。微管蛋白作为蛋白质负荷控制。n个= 3.C类，未运动对照（−）和运动后12小时（+）突变型p53 R172H骨骼肌中的相对CHCHD4 mRNA水平(*第53页^R172H/R172H*)敲小鼠。*右侧面板*骨骼肌组织及其细胞核和线粒体部分中指示蛋白质的免疫印迹。GAPDH、组蛋白H3和VDAC分别作为总蛋白、核蛋白和线粒体部分蛋白负载控制。所示为用于量化的三个独立实验的代表性免疫印迹图像。数值为平均值±S.E.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.

**图3。**
**CHCHD4的过度表达阻断运动诱导的p53核活性。** A类WT和CHCHD4-Tg小鼠在未运动对照（−）和运动后12 h（+）状态下骨骼肌中p21 mRNA和蛋白质水平。Tubulin和VDAC用作整个组织的蛋白质负荷控制(*全部的*)线粒体部分。n个= 4.B类在次最大强度跑台运动12h后，通过RT-PCR阵列分析WT和CHCHD4-Tg小鼠骨骼肌中p53调节基因的mRNA表达。在84个p53靶基因中，26个仅在运动后的WT小鼠中被诱导2.5倍或更高。与非手术对照组相比，运动后基因表达的色码折叠变化(红色，诱导；绿色，压抑）。n个= 3.C类通过RT-PCR阵列鉴定了一些具有代表性的运动诱导p53调节基因。n个= 3. 数值为平均值±S.E.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.

**图4。**
**运动诱导的FOXO3蛋白与FOXO3-DBE相互作用*CHCHD4公司*基因。** A类未运动状态下野生型小鼠骨骼肌的FOXO3免疫印迹（对照，*CTL公司*)以及指定时间点的运动后状态。显示了整个组织和核部分样品。GAPDH和层粘连蛋白B1分别作为总蛋白负荷和核蛋白负荷的对照。B类，人体上三种假定的FOXO3 DBE示意图*CHCHD4公司*启动子相对于起始密码子。所示为FOXO3与弱势商业企业之间相互作用的ChIP分析*CHCHD4公司*CCCP处理HCT116细胞6h后诱导FOXO3。输入的DNA样本被稀释为1:20用于琼脂糖凝胶图像。n个= 3.C类，CHCHD4启动子构建物的荧光素酶活性包含野生型或突变型(*多用途终端*)DBE2序列。HCT116细胞经CCCP转染后诱导FOXO3蛋白表达。对照组无CCCP治疗。n个= 4.D类，组成型活性三磷酸化突变体FOXO3（FOXO3-TM）对DBE2启动子构建体活性的影响。在荧光素酶试验前36 h，用FOXO3-TM cDNA共同转染HCT116细胞。对照组无FOXO3-TM联合转染。n个= 4. 数值为平均值±S.E.*，第页< 0.05; **,第页< 0.001.

**图5。**
**FOXO3抑制*CHCHD4公司*表达式。** A类，CHCHD4和p21在转染FOXO3-TM质粒的HCT116细胞中的表达水平。n个= 3.B类对转染FOXO3-TM质粒的HCT116细胞的细胞核部分和总细胞提取物进行p53免疫印迹。C类，代表性的p53共焦免疫荧光图像(红色)FOXO3-TM转染细胞中。DAPI染色(蓝色)显示细胞核。数值为平均值±S.E.*，第页< 0.001.比例尺=10微米。

**图6。**
**击倒FOXO3增加*CHCHD4公司*表达式。** A类用shRNA敲低CCCP诱导的FOXO3，HCT116细胞中CHCHD4和p21的表达。*NS公司*，非特异性shRNA。n个= 3.B类用shRNA敲低血清饥饿诱导的FOXO3，HCT116细胞中CHCHD4和p21的表达。n个= 3.C类CCCP或血清饥饿诱导FOXO3敲除后HCT116细胞核和总细胞组分的p53免疫印迹。D类，代表性的p53共焦免疫荧光图像(红色)CCCP或血清饥饿诱导的FOXO3基因敲除后HCT116细胞中。DAPI染色(蓝色)显示细胞核。数值为平均值±S.E.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.比例尺=10微米。

**图7。**
**运动对p53亚细胞分裂调控的综述。**运动诱导转录因子FOXO3抑制*CHCHD4公司*表达，从而阻止p53移位到线粒体并增加其核水平和活性。

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