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.2016年9月29日：6:34331。
doi:10.1038/srep34331。

大规模组织清除（PACT）：免疫荧光、组织学和超微结构的技术评估和新观点

彼得·H·内克尔 1, 乌尔里希·马修斯 1, 伯恩哈德·希尔特 1, 洛萨只是 1, 安德烈亚斯·F·麦克 1
附属公司

大规模组织清除（PACT）：免疫荧光、组织学和超微结构的技术评估和新观点

彼得·H·内克尔等。 科学代表. .

摘要

新技术，如CLARITY和PACT，使大型组织标本透明，因此适合于显微镜分析。我们使用这些技术来评估它们在肠道中作为具有复杂组织成分的典型器官的潜力。免疫组织化学、薄片和共焦扫描显微镜使我们能够追踪复杂的三维结构，如神经纤维、血管和整个器官的上皮屏障。此外，在一项系统的电子显微镜研究中，我们从超微结构水平分析了清除过程中组织的形态和保存情况。我们还将组织清除与经典组织学联系起来，并证明清除的组织可以用苏木精-伊红和海登海恩氮染色进行染色，这表明其在组织病理学中具有潜在的用途。这些实验表明，在清洗过程中保持中性pH值可以更好地保存组织超微结构和标准染色性。在方案实施过程中，对样本的体积变化进行监测和量化。此外，我们还利用这项技术来可视化死后人类肠道准备中的肠道神经系统和上皮屏障。我们的数据表明，在不同组织类型中，组织清除的潜力很大，支持其在研究和诊断中的用途，并有助于超微结构组织抑制的技术讨论。

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数字

图1
图1。肠段清理和肿胀分析。
(A类)显示了同一肠段清除方案中不同步骤的三幅图像：用浸泡在PBS中的水凝胶单体溶液固定后(左边)，在PBS中浸没被动清除后(中间的)清洗后浸没在80%的甘油中(正确的). 在展示达到的透明度的过程中，组织下方的作者研究所标志变得清晰可见。比例尺：2 毫米英寸(B–E类)2的肿胀 显示了成年小鼠肠道的mm厚横切面。在(B类)同一片(红色虚线)在结算前进行描述(左边)，结算后(中间的)清洗后浸没在80%的甘油中(正确的). 背景中的比例图案显示1 × 1 平方毫米。(C–E)量化样品在清除过程中的膨胀以及甘油培养后的连续收缩。(C类)说明用“CLARITY”治疗的一组患者的肿胀和收缩情况(灰色)或“PACT”(黑色)清除溶液。星号表示统计显著性（Kruskal-Wallis单因素方差分析，采用事后全配对多重比较（Dunn方法），n = 20，第页 = <0, 001). 在(D类)在清理过程中，可以对每个样本进行测量，以表明每个样本的结果是否一致。在(C类)我们比较了“清晰度”(灰色)或“PACT”(黑色)清除溶液，发现各组之间在膨胀和收缩效应方面没有显著差异（Kruskal-Wallis秩方差单向分析，n = 20） 。星号表示内腔有残留的食糜。
图2
图2。可视化肠道神经系统。
在A-C中，对不同清除肠道标本的ENS进行泛神经标记物HuC/D染色(A类)和TUJ-1(B类)和儿茶酚胺能神经元标记物TH(C类). 下面的显微照片显示了上部面板的图像细节，如白色边框所示。图像是在具有5x/0.16物镜的光片显微镜上以8.1的z步长间隔采集的图像堆栈的重建 1863范围内的μm 微米(A类), 2034 微米(B类)和1708 微米(C类). (D类)显示了共聚焦图像堆栈（10x/0.3物镜，针孔）中记录的肠道壁TUJ-1染色 = 1 Airy单元）。我们使用依赖深度的色码从外（红色）到内（蓝色）直观地解剖ENS神经丛层，显示肠壁不同层中ENS网络的不同形态；右侧面板显示覆盖。比例尺：(A–C)上部面板500 微米；(A–C)下部面板200 微米；D 100型 微米。图中所示的样本(B类)在补充视频1中显示，z堆栈如所示(D类)可以在补充视频2中看到。
图3
图3。肠系膜中的神经纤维和血管。
上图显示了连接肠系膜的肠道准备的示意图。(A类)显示了光片图像堆栈的重建（5x/01.16物镜，总z范围2100 μm）儿茶酚胺能神经纤维染色用于TH(B类)从共焦图像堆栈（5x/0.16物镜，针孔）重建 = 1艾里单位，z范围852 μm）神经染色泛神经标记物TUJ-1。(A类,B类)举例说明肠系膜（星号）中的神经纤维与肠壁内神经网络的整合。(C类)描绘内皮标记物CD31染色的血管，并显示来自肠系膜（星号）的血管分支和绒毛中的细毛细血管（共聚焦图像堆栈10x/0.3物镜，z范围1047 μm）。(D–F)显示肠系膜血管的神经支配((D类)CD31(E类)TUJ-1、(F类)合并）。(G–I）通过特异性儿茶酚胺能染色鉴定小动脉的非常精细的交感神经纤维。比例尺：(A–C) 500 微米；(D–F)100 微米；(G–I型) 100 微米。图中所示的样本(B类)在补充视频3中显示，并且(C类)在补充视频4和5中。血管(D类–F类)如补充视频6所示。
图4
图4。上皮染色。
(A–C)用上皮标记细胞角蛋白（绿色）和紧密连接相关蛋白ZO-1（红色、，A类)结合核DAPI染色（蓝色；B、 C类). 细胞角蛋白在细胞质中表达，细胞核除外。一些细胞显示出强烈的细胞角蛋白染色（箭头所示），而杯状细胞在细胞顶部的一半没有角蛋白染色C类). ZO-1染色可以定位根尖结合复合体，从而揭示上皮表面组织。使用20xClr Plan-Neofluar 20x/1.0 Corrn记录的光片图像堆栈的图像和重建 = 1.45目标，z步骤2 μm，总z范围370 微米。显示整个绒毛的堆栈子集在补充视频7中显示，并通过补充视频8中的杯状细胞显示。(D类)描绘了部分堆积物穿过整个肠壁的投影，显示了上皮细胞和毛细血管内皮细胞中的终末棒状复合体的网状结构。由于薄片显微镜提供的z轴高分辨率，因此可以在补充视频8中显示的飞行动画中更好地了解此图像的细节。比例尺：100 微米。
图5
图5。清除组织的经典组织学。
在肠道的横向石蜡切片上进行苏木精-伊红和海登海恩氮染色。标本之前用PACT溶液清洗过(B、 D类)中性pH或用4%PFA固定(A、 C类). 每个面板中最上面的图像显示了整个部分的概览（左）和整个肠壁的更详细图像（右）。隐窝（PC）、肠细胞、杯状细胞（GC）、肌间神经元（MN）和粘膜下神经元（SM）中的paneth细胞的高分辨率图像。在这两种制剂中，整体组织保留效果都相当好。此外，丙烯酰胺包埋明显保护绒毛尖端。比例尺：整个肠道横截面500 微米；肠壁概述200 微米；高倍图像20 微米。
图6
图6。清除组织的透射电子显微镜。
所示为固定标本的超薄切片，仅与锇进行对比(A–D左)和之前用CLARITY溶液清除的组织(A、 B中间)和PACT解决方案(A–D右侧). 在A类，概述了肠细胞，下面是肠细胞核的高分辨率图像(B类)，顶端微绒毛(C类)和亚尖端接合杂岩(D类). 所有清除的标本中的脂质都被洗掉了，这表明没有染色膜。在CLARITY溶液中清除的组织显示出收缩的人工制品和增大的核周裂(B、 箭头)以及精细结构的丢失，尤其是在肠细胞的顶端。经PACT溶液处理的组织保留了微绒毛中肌动蛋白丝等精细结构特征(C左)桥粒(D、 箭头)尽管细胞膜丢失了。比例尺：A和B 1 微米，C和D 500 nm，分别用于同一行中的所有图像。
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