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.2016年12月:48:34-47。
doi:10.1016/j.neurobiolaging.2016.08.005。 Epub 2016年8月18日。

生酮饮食加速前脑线粒体DNA毒性小鼠的神经退行性变

附属公司

生酮饮食加速前脑线粒体DNA毒性小鼠的神经退行性变

Knut H Lauritzen公司等。 神经生物老化. 2016年12月.

摘要

线粒体基因组维护在维护大脑健康方面发挥着核心作用。我们之前证明,在前脑神经元选择性表达突变线粒体DNA修复酶(mutUNG1)的转基因小鼠中,线粒体DNA损伤和严重的神经变性积累。在这里,我们研究了表达mutUNG1的小鼠的严重神经退行性变是否可以通过给小鼠喂食生酮饮食来挽救,已知生酮饮食对几种神经系统疾病具有有益作用。饮食增加了超氧化物歧化酶2、线粒体质量、酶和调节因子(如SIRT1和FIS1)的水平,并似乎下调了N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚单位NR2A/B,上调了γ-氨基丁酸A(GABA)A类)受体亚单位α1然而,出乎意料的是,生酮饮食加剧了神经退化和线粒体退化。电子显微镜显示结构受损的线粒体积聚在神经元胞体周围。我们认为,病情加重是由功能失调线粒体的线粒体生物生成增加引起的。因此,这项研究质疑了生酮饮食对线粒体疾病明显有益的教条。

关键词:生物发生;生酮饮食;线粒体DNA损伤;神经变性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露声明

作者没有实际或潜在的利益冲突。本文所述研究的所有方面都是根据挪威有关动物研究的法律进行的。

数字

图1
图1
生酮饮食如何加剧mutUNG1表达小鼠mtDNA毒性的神经退行性效应的拟议模型。生酮饮食诱导线粒体生物生成,从而增强神经组织的能量代谢和能量储备。因此,它使神经元能够更好地应对细胞应激,并提高细胞活力。在表达mutUNG1的小鼠中,mutUNG2蛋白靶向所有线粒体,产生高水平的线粒体DNA损伤,从而导致线粒体功能失调。我们认为,在这种情况下,线粒体生物生成的增加将导致能量消耗高于获得,这最终会导致能量不足。再加上大量功能失调的线粒体导致活性氧水平升高的有害影响,导致神经退化加剧,而不是缓解效果。缩写:mtDNA,线粒体DNA。
图2
图2
生酮饮食会加速mutUNG1表达小鼠海马体的萎缩、神经变性和反应性星形胶质细胞增生。(A) 海马的代表性HE染色冠状石蜡切片显示,与喂食标准饮食的野生型(上图)和表达mutUNG1的小鼠(中间图)相比,喂食生酮饮食的表达mutUNG1的小鼠(KD,下图)的萎缩和神经元变性增加。在高倍扫描照片上,对颗粒细胞层锥体下部分(dg,标记在左中面板上)100µm长范围内的细胞数量进行计数。样品图片和结果(平均值±标准偏差,n只小鼠,第页=0.05,表示下部2)之间的差异。(B) 定量海马层r+lm的厚度(冠状切片中,A标记在中间框架中)表明,与分别喂食标准饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠相比,喂食生酮饮食的mutUNG2表达小鼠的海马体积显著减小(n=3只/组,第页=0.02和第页= 0.03). (C) 在喂食标准饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠和喂食生酮饮食的mutUNG2表达小鼠中,海马冠状石蜡包埋切片免疫标记神经元标记物MAP2,后者显示标记的锥体和颗粒细胞树突丢失。(D) 免疫染色的定量显示,与喂食标准饮食的野生型和表达mutUNG1的小鼠相比,喂食生酮饮食的表达mutUNG1的小鼠中MAP2的显著降低(每组n=3只小鼠,第页<0.0001和第页< 0.0001); 喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠也与野生型小鼠不同(第页= 0.01). (E) 对喂食标准饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠以及喂食生酮饮食的mutUNG2表达小鼠的海马冠状石蜡包埋切片进行星形胶质细胞标记GFAP免疫染色。(F) 免疫荧光定量显示,与标准饮食喂养的野生型和mutUNG1表达小鼠(每组3只,第页= 0.003,第页< 0.0001). (C)和(E)中的虚线矩形表示用于免疫反应性定量的感兴趣区域。比例尺=100微米(C和E)和20微米(A中的右侧面板)。星号系列标志着lm和m之间的海马裂。在本图和后续图中,统计显著性水平用星号表示(*第页≤0.05**第页≤ 0.01; ***第页≤0.001)。缩写:dg,齿状回颗粒细胞层;h、 齿状回门;HE、苏木精和曙红;lm,海马CA1的腔隙分子层;m、 齿状回分子层;o、 地层定向;p、 锥体细胞层;r、 放射状地层。
图3
图3
喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠上调了线粒体抗氧化防御。(A) SOD2(绿色)免疫标记石蜡包埋海马的冠状切片表明,在喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠中,线粒体抗氧化防御受到诱导,而喂食生酮饮食(KD)的mutUNG1表达鼠的线粒体抗氧化防御能力进一步增强。核DNA编码的电子传递复合物II(红色,中间行)在所有3种条件下的分布与SOD2相似。在合并的框架中(底行),黄色或橙色表示免疫反应在相同结构中的共定位。在有生酮饮食和无生酮饮食的mutUNG1小鼠中,周核(箭头)的线粒体标记较强,但在野生型小鼠中没有。mutUNG1+KD的红色和绿色比仅mutUN1的更亮。带斑点的矩形表示用于量化免疫反应的感兴趣区域(B),带斑点的正方形表示特写图片的大致位置(C)。比例尺=100µm(物镜10×)。(B) SOD2和线粒体复合物II免疫荧光定量(如A(顶部)所示,矩形区域的平均面积。与野生型相比,突变UNG1小鼠的SOD2增加(第页=0.003)和喂食生酮饮食的mutUNG1小鼠(第页< 0.0001). 当喂食生酮饮食时,mutUNG1小鼠的复合物II增加(第页= 0.001). (C) 高倍放大相当于A中点状正方形的区域,显示SOD2和复合物II在神经元胞周(dg细胞,大箭头)和神经膜(小箭头)的线粒体样结构中的共定位。在表达mutUNG1的小鼠中,尤其是在生酮饮食时(右下框),这种结构簇积聚在神经元胞体周围。比例尺=10µm(物镜63×油浸)。缩写:dg,颗粒细胞层;h、 齿状回门;lm,海马CA1的液泡分子层;m、 齿状回分子层;o、 地层定向;p、 锥体细胞层;r、 辐射层;SOD2、超氧化物歧化酶2;星号系列标记着lm和m之间的fissura hippocampi
图4
图4
生酮饮食上调mutUNG1表达小鼠的抗氧化防御(SOD2)、线粒体裂变活性(FIS1)和长寿相关脱乙酰酶(SIRT1)。(A) SOD2和线粒体标记VDAC1在Western blots中定量,并归一化为ActB作为负荷控制。在mutUNG1小鼠中,SOD2与野生型相比增加了几倍(第页<0.001),在mutUNG1小鼠中,生酮饮食使其加倍(第页= 0.03). VDAC1仅显示相同条件下的微小变化。(B) 同样,与标准饮食(SIRT1)的mutUNG1小鼠相比,mutUNG2小鼠的生酮饮食显著上调了FIS1和SIRT1第页=0.006,FIS1第页=0.007),以及与野生型小鼠(SIRT1第页=0.005,FIS1第页= 0.03); *第页≤0.05**第页≤ 0.01. 缩写:SOD2,超氧化物歧化酶2;VDAC1,电压依赖性阴离子通道1。
图5
图5
mutUNG1表达小鼠喂食生酮饮食。(a)电子显微镜对CA1锥体细胞体线粒体面积的量化显示,喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠的线粒体质量显著增加(第页=0.02)和喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠(第页=0.01),与喂食标准饮食的野生型小鼠相比。(B) 电子显微镜下CA1放射层突触前终末线粒体面积的定量显示,喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠的线粒体质量显著降低(第页=0.05),在喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠中(第页=0.03)。数据表示为平均值±标准偏差*第页≤0.05**第页≤ 0.01. 缩写:KD,生酮饮食。
图6
图6
生酮饮食会加剧mutUNG1表达小鼠的核周堆积和线粒体肿胀。(A和B)海马CA1中锥体细胞体(A)和放射状神经层(B)的代表性电子显微照片,显示mutUNG1表达小鼠、对照组和生酮饮食(KD)的线粒体形态异常,表明线粒体功能失常和线粒体动力学崩溃。在针对每种情况分析的3只小鼠中选择了两张电子显微照片(左上角的识别号),以说明典型的形态。线粒体被分类为分别显示正常的深色(D)外观和肿胀的浅色(L)外观。(N=细胞核。)比例尺=200 nm。(C和D)量化CA1锥体细胞体(C)细胞质和兴奋性突触(D)神经末梢的线粒体质量百分比(确定为组织切片中线粒体轮廓的百分比面积)。将每只动物(每组3只小鼠)的每种结构的线粒体和细胞质面积分别汇总,计算百分比,并将其表示为每种情况的平均值±标准误差(SEM)。在mutUNG1小鼠的体细胞中,生酮饮食(KD)与黑暗线粒体相比显著增加了光线粒体的数量(第页= 0.01). 野生型小鼠的轻线粒体明显少于喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠(第页=0.03),与喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠相比(第页=0.009)。在突触前兴奋性终末,野生型小鼠的暗线粒体明显多于亮线粒体(第页=0.01),与喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠相比,暗线粒体更多(第页= 0.03). 值得注意的是,生酮饮食显著增加了体细胞中轻线粒体的积累:正常饮食的mutUNG1小鼠的轻线粒体与暗线粒体的比例为2.1±0.6,而生酮饮食的mut UNG1鼠的比例为5.7±0.4(平均值±扫描电镜)(第页= 0.008); *第页≤0.05**第页≤ 0.01.
图7
图7
生酮饮食加速兴奋性突触处谷氨酸受体分布的变化。(A–C)显示了(A)喂食标准饮食的野生型(B)mutUNG1-表达小鼠和(C)喂食生酮饮食的mutUNG2-表达小鼠CA1区域放射层中代表性兴奋性突触的显微照片。红色箭头表示金色颗粒(黑点),代表突触后膜内标记的NR2A/B受体亚单位(受黑色箭头限制)。比例尺=100 nm。(D–F)量化海马CA1区放射层中兴奋性AMPA受体亚单位GluR1(D)、GluR2/3(E)和NMDA受体亚单位NR2A/B(F)。计数突触后膜两侧25 nm范围内的金颗粒。GluR1和GluR2/3标记在3组小鼠之间无统计学差异。NR2A/B标记显示,喂食标准饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠之间显著减少(第页=0.03)和在喂食生酮饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠之间(第页= 0.01). 曼·惠特尼U型测试(#)显示显著降低(第页与标准饮食(n=152个突触)相比,生酮饮食(n=140个突触,mutUNG1表达小鼠的突触NR2A/B标记值=0.04)。数据显示为每µm的平均亚单位再现粒子数2±标准偏差,n=3只/组*第页≤0.05**第页≤ 0.01. 缩写:KD,生酮饮食;m、 线粒体;s、 突触后棘;t、 突触前终末;v、 突触小泡。(有关此图例中颜色参考的解释,请读者参阅本文的Web版本。)
图8
图8
GABA公司A类海马CA1区的受体分布。(A–C)图示CA1锥体细胞体上代表性抑制性突触的显微照片适用于(A)野生型、(B)喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠和(C)喂食生酮饮食的mut UNG1表示小鼠红色箭头表示代表标记GABA的金颗粒(黑点)A类γ2突触膜上的受体亚基(受黑色箭头限制)。比例尺=100 nm(D和E)抑制性GABA的定量A类α1(D) 和GABAA类γ2(E) 受体亚单位。计数突触后膜25 nm范围内的金颗粒。GABA公司A类α1标记显示,喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠显著增加(第页=0.02),而GABA没有显著差异A类γ2在3组小鼠之间进行标记。数据显示为每µm的平均亚单位再现粒子数2±标准偏差,n=3只/组*第页≤ 0.05. 缩写:KD,生酮饮食;m、 线粒体;胞体;t、 突触前终末;v、 突触小泡。(有关此图例中颜色参考的解释,请读者参阅本文的Web版本。)

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