Reep1 null mice reveal a converging role for hereditary spastic paraplegia proteins in lipid droplet regulation

doi:10.1093/hmg/ddw315

.2016年12月1日；25(23):5111-5125.

doi:10.1093/hmg/ddw315。

Reep1基因缺失小鼠揭示了遗传性痉挛性截瘫蛋白在脂滴调节中的聚合作用

贝诺·t反致¹, 布丽安娜·马龙¹, 梅兰妮·法尔盖罗², 杰瓦·穆纳辛格^三, 朱莉娅·斯塔德勒¹, 卡罗琳·西比拉¹, Seong H公园¹, 克雷格·布莱克斯通¹

附属公司

¹神经遗传科细胞生物学科。
²发育神经生物学科。
^三美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所功能和分子成像实验室。

PMID： 27638887
预防性维修识别码： PMC6078631项目
内政部： 10.1093/hmg/ddw315

Reep1基因缺失小鼠揭示了遗传性痉挛性截瘫蛋白在脂滴调节中的聚合作用

贝诺·t反致等。人类分子遗传学. 2016.

.2016年12月1日；25(23):5111-5125.

doi:10.1093/hmg/ddw315。

作者

贝诺·t反致¹, 布丽安娜·马龙¹, 梅兰妮·法尔盖罗², 杰瓦·穆纳辛格^三, 朱莉娅·斯塔德勒¹, 卡罗琳·西比拉¹, Seong H公园¹, 克雷格·布莱克斯通¹

附属公司

¹神经遗传科细胞生物学科。
²发育神经生物学科。
^三美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所功能和分子成像实验室。

PMID： 27638887
预防性维修识别码： PMC6078631项目
内政部： 10.1093/hmg/ddw315

摘要

遗传性痉挛性截瘫（HSPs；SPG1-76及其他）是影响长皮质脊髓轴突的长度依赖性疾病，最常见的常染色体显性形式是由编码痉挛素（SPG4）、阿特拉斯汀-1（SPG3A）和REEP1（SPG31）蛋白的基因突变引起的。这些蛋白质相互结合，形成贯穿细胞的管状内质网（ER）网络。它们还参与细胞内脂滴的形成、扩大或两者兼而有之，但机制尚不清楚。在这里，我们已经确定了Reep1基因敲除小鼠存在部分脂肪萎缩以及明显的痉挛性截瘫的证据。此外，Reep1-/-胚胎大脑皮层的成纤维细胞和神经元都表现出脂滴异常。Reep1基因敲除小鼠中明显的部分性脂肪营养不良，虽然不太严重，但令人想起在最常见的常染色体隐性脂肪营养不良症，即Berardinelli-Seip先天性脂肪营养障碍症中观察到的脂肪萎缩表型。Berardinelli-Seip脂肪营养不良是由编码ER蛋白seipin的BSCL2基因的常染色体隐性突变引起的，该蛋白也在常染色体显性HSP SPG17（Silver综合征）中突变。此外，REEP1与细胞中的seipin共同免疫沉淀。这加强了内质网形态发生改变与脂质异常之间的联系，对最常见形式的热休克蛋白具有重要的致病意义。

牛津大学出版社2016年出版。这部作品由美国政府雇员撰写，在美国属于公共领域。

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数字

图1
*Reep1号机组-/-*小鼠表现出运动功能障碍和轴突异常。(A类)Rotarod持续时间测试*Reep1号机组+/+* 和*Reep1−/−* 2个月龄的小鼠(n个 = 20). 使用TreadScan步态设备（速度）获得行走时间和打印面积 =14 厘米/秒；n个 = 20); 方法 ± 扫描电镜****P（P）* < 0.001. (B类)10×诱发的类运动活动频率刺激背根神经节的阈值序列****P（P）* < 0.001. (C类)测量L5腹根的单突触反射潜伏期。左侧，实验装置；运动神经元是蓝色的，传入神经元是红色的。对，叠加的痕迹显示了一个神经元记录的平均单突触反射*Reep1号机组+/+* 和一个*Reep1号机组-/-*动物。(D类)2×的平均单突触潜伏期和10× 阈值。手段 ± 扫描电镜**P（P）* < 0.05, ****P（P）* <0.001. ns，不显著。(E类)细胞内记录的L5运动神经元的逆行潜伏期。(F类)L5脊髓横切面显示背根纤维充满荧光右旋糖酐（红色），运动神经元为蓝色。比例尺，100 微米。(**G公司**)平均尺寸 ± L5运动神经元的SEM计算F类. ****P（P）* < 0.001. (**H（H）**)微丝100 取4月龄小鼠颈脊髓μm切片，甲苯胺蓝染色。比例尺，100 微米。(我)腹束轴突直径（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 3). ****P（P）* < 0.001. (J型)皮质神经元裂解物中Reep1蛋白的免疫印迹，以肌动蛋白作为负荷控制。(**K（K）**)代表性DIV6皮层神经元的β-微管蛋白染色（黑色）。比例尺，20µm。(我)左，DIV3神经元初级轴突长度的量化（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 3，每次试验30个神经元），REEP1过度表达**P（P）* < 0.05. ns，不显著。右，神经元初级轴突分支的量化（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 3，每次试验30个神经元）***P（P）* < 0.01.

图2
*Reep1号机组*破坏导致脂肪营养不良。(A类)代表性照片*第1卷+/+* 和稀释剂*Reep1−/−* 老鼠。(B类)图像显示腹部白色脂肪沉积减少（黑色箭头）*Reep1−/−* 老鼠。(C类)用BODIPY 594染色的脂肪组织切片照片。比例尺，500µm。(D类)年总脂肪组织CT扫描分析的代表性图像*Reep1号机组+/+* 和*Reep1−/−* 老鼠。(E类)脂肪组织体积*Reep1号机组+/+* 和*Reep1−/−* 根据CT扫描定量的小鼠，如D类(n个 = 10只老鼠，意思是 ± 扫描电镜****P（P）* < 0.001). (F类)Reep1和Reep2的免疫印迹分析。肌动蛋白作为蛋白质负荷的对照进行监测。WAT，白色脂肪组织。#，非特异性带。

图3
血脂参数改变*Reep1号机组-/-*老鼠。(A类)血清甘油三酯、胆固醇和胰岛素在*Reep1−/−* 老鼠。胆固醇；高密度脂蛋白；低密度脂蛋白。(**B–C**)脯氨酸的定量qRT-PCR分析(B类)和反(C类)使用Qiagen小鼠脂肪生成PCR阵列的脂肪生成mRNA。图表显示了方法 ± 扫描电镜(n个 = 3只小鼠，每只一式三份）**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001.

图4
LD变化*Reep1号机组-/-*小鼠大脑皮层。（A）代表T₂弛豫时间图（补充材料中的额外细节，图S4D和E）*Reep1号机组+/+* 和*Reep1−/−* 大脑。T的像素强度₂地图代表数量T₂值（以右侧的毫秒刻度条为单位）。(B类)大脑皮层切片*Reep1号机组+/+* 和*Reep1−/−* 小鼠微管蛋白（灰色）、LDs（Vala；绿色）和DAPI（蓝色）染色。方框区域在下面放大。比例尺，100µm。(C类)根据切片对神经元胞体中LD的数量和大小进行量化，如B类(n个 = 3只老鼠，意思是 ± SEM）**P（P）* < 0.05.

图5
LD异常*Reep1号机组-/-*老鼠。(A类)内源性Reep1蛋白表达的免疫印迹分析*Reep1号机组+/+* 总匀浆（Homog）和膜组分（Memb）中的神经元和MEF。(B类)MEF的LD540染色*Reep1号机组*+/+ 和*Reep1号机组*−/− 小鼠用油酸治疗前后。方框区域在右上角的插图中放大。比例尺，10µm。(C类)总LD540和BODIPY 594染色强度的图示*Reep1号机组*+/+ 和*Reep1号机组*−/− 油酸处理前后的MEF（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 60). ****P（P）* < 0.001. (D类)MEF分化受损。MEF来自*第1卷+/+* 和*Reep1号机组-/-*培养小鼠并分化为脂肪细胞。显示LDs油红O染色和DAPI（蓝色）染色细胞核。比例尺，10µm。(**E-F公司**)数量的量化(E类)和尺寸(F类)转染（+REEP1）或未转染REEP1表达结构的MEF细胞中的LD，并用油酸处理（红色）或未处理（蓝色）***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001. (**G-H公司**)细胞定量（如C类)带TIP47⁺LD输入*Reep1号机组+/+* 和*Reep1−/−* 用油酸处理指定时间后的MEF。方框区域在正下方放大。比例尺，20µm。(我)用TIP47定量细胞⁺油酸处理后几个时间点的LD。*P（P）* < 0.001.

图6
周脂蛋白磷酸化增加*Reep1号机组-/-*细胞。(A类)MEF总裂解物中紫苏素的免疫印迹*Reep1号机组+/+* 和*Reep1−/−* 小鼠（分别为～2.5和0.8的相对表达水平）。监测PLCγ水平，作为蛋白质负荷的控制。(B类)紫苏素的磷酸化缺陷*Reep1号机组*-/-中小微企业。(C类)*Reep1号机组*+/+ 和*Reep1号机组*-/-在存在或不存在油酸的情况下，MEF与位点选择性亲脂性PKA抑制剂（Rp-8-PIP-cAMPS）孵育。*Reep1号机组*+/+ 和*Reep1号机组*-/抑制剂处理后，细胞显示LDs的高积累，表明紫苏素磷酸化缺陷*Reep1号机组*-/-老鼠。(D类)LD周长的量化C类（指 ± 扫描电镜；n个 = 60). ****P（P）* < 0.001. 比例尺，10µm。

图7
LD540染色*Reep1号机组+/+* 和*Reep1−/−* 如图所示，转染Reep1、atlastin-1或atlastin-1K80A结构体的MEF。图表表示用油酸处理前后的细胞数量（平均值 ± 扫描电镜；n个 = 50). **P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001. 比例尺，10µm。

图8
SPG17蛋白seipin与REEP1相互作用。(A类)用Myc-REEP1和HA-seipin构建物共同转染NIH-3T3细胞。用抗Myc和抗HA抗体免疫沉淀细胞裂解物，并对HA（seipin）和Myc（REEP1）表位进行免疫印迹，如图所示。(B类)如图所示，对所示基因型的小鼠大脑提取物进行免疫沉淀（IP），然后对atlas-itn-1、seipin和Reep1进行免疫印迹。左侧使用的面板*Reep1号机组+/+* 提取物。(C类)Imuno沉淀（IP）按照B类除了提取物首先与DSP交联，然后在SDS-PAGE样品缓冲液中裂解。(D类)共转染COS7细胞后HA seipin（绿色）和Reep1（红色）构建体的分布。比例尺，10 微米。

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1. Blackstone C.（2012）遗传性痉挛性截瘫的细胞途径。每年。神经科学版。，35, 25–47.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Tesson C.，Koht J.，Stevanin G.（2015）《深入研究遗传性痉挛性截瘫的复杂性：表型和遗传模式正在彻底改变其病因学。嗯，遗传学。，134, 511–538.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Fink J.K.（2013）遗传性痉挛性截瘫：临床病理特征和新兴分子机制。神经病理学学报。，126, 307–328.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Harding A.E.（1993）遗传性痉挛性截瘫。塞明。神经病学。，13333-336之间。-公共医学

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[1] Blackstone C.、O'Kane C.J.和Reid E.（2011），遗传性痉挛性截瘫：膜交通和运动通路。神经科学自然评论。，12, 31–42.-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Blackstone C.、O'Kane C.J.和Reid E.（2011），遗传性痉挛性截瘫：膜交通和运动通路。神经科学自然评论。，12, 31–42.-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Blackstone C.（2012）遗传性痉挛性截瘫的细胞途径。每年。神经科学版。，35, 25–47.-项目管理咨询公司-公共医学

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[5] Tesson C.，Koht J.，Stevanin G.（2015）《深入研究遗传性痉挛性截瘫的复杂性：表型和遗传模式正在彻底改变其病因学。嗯，遗传学。，134, 511–538.-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Tesson C.，Koht J.，Stevanin G.（2015）《深入研究遗传性痉挛性截瘫的复杂性：表型和遗传模式正在彻底改变其病因学。嗯，遗传学。，134, 511–538.-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Fink J.K.（2013）遗传性痉挛性截瘫：临床病理特征和新兴分子机制。神经病理学学报。，126, 307–328.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Fink J.K.（2013）遗传性痉挛性截瘫：临床病理特征和新兴分子机制。神经病理学学报。，126, 307–328.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Harding A.E.（1993）遗传性痉挛性截瘫。塞明。神经病学。，13333-336之间。-公共医学

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